深低温停循环后梯度灌注复温脑保护的实验研究

陆兆辉  王伟  徐志伟  朱德明

上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心  心脏外科，上海 200127

基金资助：上海市高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金（JDY06045）

作者简介：（1978-02），男，住院医师，博士；通讯作者：朱德明

目的：深低温停循环（deep hypothermia circulatory arrest，DHCA）后应用梯度灌注复温，调整脑组织血流-温度-代谢平衡，籍以优化体外循环复温过程中的神经保护策略。

方法：实验对象为3-4周龄的上海白猪（n=12），雌雄不拘，体重9.775±0.93Kg；将实验动物随机分为两组，建立微创的乳猪DHCA灌注模型（肛温18℃）；A组为实验组（n=6)，DHCA停循环90分钟，术后复温策略为梯度灌注复温，肛温每升高5℃，维持平台温度15分钟；B组为对照组（n=6），DHCA停循环90分钟，按照常规复温。以肛温33℃为目标恢复温度。两组均采用pH稳态方法管理血气。于术中监测试验动物的肛温、心率、心电图、血气分析、颈动脉血流量、颈静脉谷氨酸/天冬氨酸浓度，术后1小时取出试验动物脑组织，应用免疫组化方法对脑组织内的损伤敏感因子，NFB组分p50 蛋白的表达进行测定。

结果：实验组的复温时间为67.3±7.8min，对照组的复温时间为41.8±3.6min（P<0.05）；分别于体外循环开始后10分钟、复温开始后15分钟、30分钟、45分钟进行采样。结果表明，实验组和对照组的脑血流量在复温后15分钟时无明显区别，而升温30分钟和45分钟时实验组的脑血流量显著低于对照组（P<0.05）；升温30分钟和45分钟时实验组的BE值明显低于实验组（P<0.05）；高压液相色谱（HPLC）分析表明升温30分钟和45分钟时对照组颈静脉谷氨酸浓度高于实验组，而仅在升温45分钟时，对照组的颈静脉天冬氨酸的浓度高于实验组。免疫组化分析表明两组之间没有明显差异。

结论：梯度灌注复温能够在深低温停循环后复温过程中起到一定的神经保护作用。其神经保护效应可能与保持复温阶段脑部血流-代谢-温度平衡有关。

关键词：深低温；停循环；再灌注；复温；

Neuoprotective Effect of Gradient Perfusion-rewarming after Deep Hypothermia Circulatory Arrest

Abstract

Objective: To evaluate the neuroprotective effect of gradient perfusion-rewarming after deep hypothermia circulatory arrest (DHCA) in piglets.

Methods: 12 Shanghai piglets (3-4 weeks old) were randomly divided into two groups of A (experiment group) and B (control group), average weight 9.775±0.93Kg. Animal CPB model is completed with microinvasive technique. DHCA duration is 90 min in two groups. During the rewarming period, group A was rewarmed with gradient perfusion strategy, maintain the temperature for 15 min every 5 ℃ elevation of the core temperature. Group B was rewarmed according normal consistent rewarming strategy. PH-stat management is adopt in both groups. Blood gas analysis, rectal temperature, heart rate, ECG, blood flow rate of carotid artery, glumatic acid/ aspartate level of jugular vein and protein NFB of brain tissue are monitored during and/or after the cardiopulmonary bypass (CPB).

Results: Duration of rewarming in group A is 67.3±7.8min, and 41.8±3.6min in group B (P<0.05). Sample collected at the beginning of CPB, 15 min of rewarming, 30 min of rewarming and 45 min of rewarming show that there is no difference between the blood flow rate at 15 min of rewarming; difference are shown at the 30 min and 45 min of rewarming (p<0.5). High performance liquid chromatography (HPLC) analysis show the obvious difference of glumatic acid level of jugular vein at 30 min of rewarming and 45 min of rewarming (p<0.5), this kind of difference of aspartate can only be seen at the 45 min of rewarming. Immunohistochemistry analysis show there is no difference of brain damage in two groups.

Conclusion: Controlled gradient perfusion-rewarming strategy can improve the neuroprotective effect during DHCA, keeping the balance of the blood flow, cerebral local temperature and brain metabolism might be the mechanism.

Key Words：Deep Hypothermia; Circulatory Arrest; Perfusion; Rewarming

近十年来，婴幼儿先天性心脏病的纠治技术进展迅速，围手术期并发症及死亡率显著下降，但体外循环手术后脑部并发症－脑功能紊乱发生率仍比较高[1]，据统计体外循环手术后60%的病人有不同程度的脑功能紊乱，症状轻重不等，可呈轻微的行为改变、暂时性记忆丧失，严重的可出现昏迷、抽搐、偏瘫、截瘫等，虽然多数程度较轻，且呈一过性，神经系统症状迅速恢复而无后遗症，但少数病人属严重脑缺血缺氧，可因而致残甚至死亡。对于婴幼儿来说，优化先天性心脏病围手术期的神经保护策略对于患儿的生存率和远期生存质量起着至关重要的作用。

深低温停循环技术（Deep Hypothermia Circulatory Arrest, DHCA）在新生儿和小婴儿复杂先心病的外科救治中有无可替代的作用，是心血管手术发展史上的里程碑，近年来的研究发现，DHCA时应用pH-stat可获得较Alpha-stat更好的脑保护效果[2]，尤其在小婴儿深低温体外循环下，不会产生脑组织奢灌和颅内压增高。但是对于DHCA复温过程的控制，在学界还有存在一定的争论[3]。本研究拟应用梯度灌注复温技术，并对其神经保护效应进行探讨。

1. 材料和方法
   • 1.1 材料：上海白猪12只（上海刘行畜牧养殖场），年龄在3到4周，雌雄不拘。体重8.5-11.3Kg（9.775±0.93Kg）。随机将实验动物分为2组，分别为实验组（n=6）和对照组（n=6）
   • 1.2 麻醉及监护：氯胺酮（25mg/Kg）和阿托品（20μg/Kg）肌注诱导麻醉，耳静脉静脉注射硫苯妥钠和乙酰琥珀胆碱维持。然后气管插管，进行机械通气（servo ventilator 900C），潮气量15ml/Kg，吸入氧浓度40％，呼吸频率20次/分钟。采用hwelett packard 78354C进行心电监护，CH-1 intermocoupie & 400 series thermistor TM2000监测食道温度和肛温。监测血气(AVL 990 Automatic Blood Gas System)，测定血清钙离子(AVL 988-3 Electrolyte Analyger)。
   • 1.3 DHCA模型的建立：所有的手术过程都采用无菌技术，术前一天给与青霉素钠80万单位肌注，术中10万单位静脉维持。游离两侧股动脉，左侧股动脉置套管并连接心电监护仪监测动脉血压，右侧股动脉置入动脉灌注插管（8～10F），夹闭插管备用。在气管旁右侧作一3cm切口，沿胸锁乳突肌内侧入路游离右侧颈内动、静脉，置放超声探头（T 206 Small animal blood flow probe, Transonic System Inc. Ithaca, New York 14850 U.S.A.）监测颈内动脉血流量，右侧颈内静脉置套管用于补液、给药和抽取静脉血标本。右侧肋间作一4cm切口，逐层分离，暴露心包，切开并悬吊之，暴露右心房进行心耳插管（20～24F），建立体外平行循环。心肺循环装置包括Sarns 7400滚压式血泵、儿童型Metronic氧合器和动脉过滤器（宁波菲拉尔医疗用品厂）。转流量为80～90ml/Kg/min。pH-stat吹入5％CO2＋95％O2的混合气[2]。预充量（400～600ml）包括：猪全血（术前一日采自成年白猪）250～350ml、血定安（Gelofusine 琥珀酰明胶注射液）100～200ml、地塞米松5mg/Kg、速尿20mg、碳酸氢钠溶液50ml、肝素5000单位。转流降温/升温通过水浴变温系统（Sarns Temperature Control and Monitor System）进行，注意保持水浴温度与小猪体温之间差异不超过10℃。控制室内温度在20～25℃，降温开始时往小猪腹部、胸部和脑部置放冰袋，促进均衡降温。降温至食道温度18℃/肛温20℃时，停止转流和机械呼吸。以心电图成一直线为循环停止标志。停循环即刻鼓肺并挤压肝脏促进静脉回流，然后夹闭动脉灌注管。停循环90分钟后进行转流复温，转流至食道温度23～27℃时，如果出现室颤，用10～20焦耳电极除颤。
   • 1.4 数据采集：在试验过程中全程监测试验动物基础生理指标，包括心率、血压、温度等。与转流开始后10分钟、复温复流后15分钟、30分钟、45分钟，分别测定实验动物颈动脉血流量，采集颈静脉血样本，并进行血气分析。颈静脉谷氨酸含量和天冬氨酸含量应用HPLC（HP1100型）技术进行分析测定。
   • 1.5 海马区域组织准备：术毕颈内动脉置套管针，接入微量泵（Barrington, 1L 60010 U.S.A.），以80ml/min的速度往脑内注入冰盐水约500ml，继之注入4％多聚甲醛约500ml。15分钟后开颅取脑，脑组织已经变得质地较硬，切开硬脑膜，用食指沿蛛网膜下腔深入脑干部钝性离断，取出完整脑组织。将完整的脑组织浸泡入500ml4％的多聚甲醛过夜。将4％多聚甲醛固定好的脑组织冠状切开，暴露海马，将海马钝性剥离。将完整剥离的海马投入新鲜配置的30％蔗糖溶液中脱水处理，直至海马沉至杯底（一般需1～2天）。然后取出海马在PBS中冲洗两次洗去蔗糖溶液，用OCT（Sakura Finetek U.S.A., Inc. Torrance, CA 90501 USA）包埋放入－80℃冰箱备用切片。
   • 1.6统计方法：应用SPSS 13．0统计软件进行资料的统计学处理，计量资料采用均数±标准差(x±S)表示，均数比较采取多因素方差分析，P<0．05为有显著性差异，P<0．01为有非常显著性差异。
2. 结  果
   • 2.1 复温时间：实验组的复温时间为67.3±7.8min，对照组的复温时间为41.8±3.6min（P<0.05）。
   • 2.2 脑血流量：实验组和对照组的脑血流量在复温后15分钟时无明显区别，而升温30分钟和45分钟时实验组的脑血流量显著低于对照组（表1）。

表1  组间不同时间点脑血流量对比

Tab 1 Blood flow in groups at different time

• 2.3 颈静脉谷氨酸及天冬氨酸含量：实验组中升温开始15min与升温30min时谷氨酸浓度没有差异（p>0.05），但是升温15min和升温45min时谷氨酸的浓度有明显差异（p<0.05）。随着转流时程增加对照组中谷氨酸的浓度变化与实验组相同。实验组和对照组两组之间在转流开始时谷氨酸浓度无差异（p>0.05），升温15分钟时两组间谷氨酸浓度无明显差异，升温15min时和升温45min时对照组谷氨酸浓度明显高于实验组（p<0.01）。

2.4实验组中升温15min与升温30min时天冬氨酸浓度无明显差异（p>0.05），升温45min时比升温30min、升温15min天冬氨酸浓度高(p<0.01)。对照组中天冬氨酸浓度变化与实验组中相同。两组间在升温15min时天冬氨酸浓度无明显差异（p>0.05），在升温30分钟时两组天冬氨酸浓度也无明显差异（p>0.05），升温45分钟时对照组天冬氨酸浓度则明显高于实验组（p<0.05）。

表2  不同时间点颈静脉谷氨酸含量（μmol/L）

Tab 2  Level of glumatic acid at different time

表3  不同时间点颈静脉天冬氨酸含量（μmol/L）

Tab 3  Level of aspirate at different time

值得提出的是，复温阶段颈静脉谷氨酸和天冬氨酸的浓度均明显高于刚开始转流时（P<0.01），因此未在上述数据中予以列出。这可能跟长时间深低温停循环（90min）有关。临床上DHCA的时程一般限制在45分钟以内。

• 2.5 免疫组化分析：NFkB在正常脑组织是不表达的，因此可以将其作为一个脑损伤因子进行监测[4]。以NfkB的表达阳性率代表脑组织损伤的程度。实验组和对照组中NFkB都有表达，图像分析光密度值分别为：10.24±3.24％、11.89±2.94％。两组之间没有明显差异。

表 4  海马区域NfkB表达阳性率（%）

Tab 4  expression of NfkB in hippocampus of piglet

图1：NFkb在小猪海马组织中的表达（×200）

Fig 1  expression of NfKB in CA1 and CA3 of hippocampus of piglet

A：小猪海马CA1区空白对照细胞未见明显棕黄色颗粒

B：小猪海马CA3区空白对照细胞未见明显棕黄色颗粒

C：小鼠海马在两组中CA1区可见细胞明显呈棕黄染色

D：小鼠海马在两组中CA3区可见细胞呈明显棕黄染色

3. 讨论
   • 体外循环是保证先天性心脏病患者及其他心血管外科手术成功的重要保障，近年来受到临床医师的关注程度在不断提高[5]。深低温停循环技术（DHCA）使得一些复杂先心病及大血管疾病的外科纠治得以顺利进行。但DHCA也有其自身的局限性，其对神经系统的负面影响还有待进一步深入研究。Greely WJ等的研究表明[6,7]，在DHCA中中脑组织血流-能量代谢比例异常，造成温度系数（Q10）的异常，Kern等研究表明，婴幼儿脑组织温度系数（Q10 =3.65)高于成人（Q10 =2.6），表明温度变化对婴幼儿造成的影响要大于成人，更应引起我们的重视。DHCA因脑组织代谢障碍诱发的继发性病理级联反应可能是造成神经损害的关键所在。
   • 我们以幼猪为实验对象，尝试应用梯度灌注复温的理念，来进一步优化DHCA复温阶段的脑保护策略。研究中测定颈静脉的谷氨酸和天冬氨酸含量来间接反应脑损伤的程度，结果表明，在组内对比中，复温30分钟时兴奋性氨基酸的含量都教复温开始有明显升高，这可能代表了停循环过程中脑组织无氧代谢所产生的一些兴奋性氨基酸在复流后集中释放；而天冬氨酸的含量在复温后45分钟仍有明显升高，可能反映了脑组织的再灌注损伤。组间对比则表明实验组的兴奋性氨基酸浓度要相对低于对照组（谷氨酸：复温30min、45min；天冬氨酸：复温45min）。不同复温阶段的脑血流量也有明显差异，复温30分钟和45分钟时实验组的脑血流量低于对照组，这跟温度的控制有一定关系，说明在温度控制的情况下，也能控制脑血流量过快增加，避免脑组织奢灌，继而引发能量代谢的失衡。海马区域的组织学评价并未得到阳性结果，90分钟的DHCA对脑组织均造成了一定程度的损害。

体外循环中温度控制起着非常重要的作用[8]，我们的动物实验表明DHCA后梯度灌注复温策略可以使脑部血流量上升更加平稳，减少兴奋性氨基酸的释放，实验组在复温阶段的脑血流量因为温度-压力控制而缓慢上升，可能与神经组织代谢之间达成一种平衡状态，从而起到一定的神经保护效应；但组织学检查并未检验出梯度再灌注有明显的神经保护效应。这可能跟DHCA的时程较长，脑组织损伤总体较为严重有关，也可能由于术后观察时间较短，未能对神经损伤进行长期动态的监测，因此今后应该倾向于对DHCA后长期神经功能监测方面的研究。

参考文献：

1: Greeley WJ, Kern FH, Meliones JN, Ungerleider RM. Effect of deep hypothermia and circulatory arrest on cerebral blood flow and metabolism. Ann Thorac Surg. 1993 Dec;56(6):1464-6.

2：Priestley MA, Golden JA, O’Hara IB, et al. Comparison of neurologic outcome after deep hypothermic circulatory arrest with alpha-stat and cardiopulmonary bypass in newborn pigs. J Thorac Cardiovasc Surg.2001,121(2):336-43

3: Tveita T. Rewarming from hypothermia. Newer aspects on the athophysiology of rewarming shock. Int J Circumpolar Health. 2000 Oct;59(3-4):260-6.

4. Nanri KC, Montecot V, Springhetti JS, et al. The selective inhibitor of neuronal nitric oxide synthase, 7-nitroindazole, reduces the delayed neuronal damage due to forebrain ischemia in rats. Stroke. 1998,29:1248–1253

5. 朱德明, 王伟. 我国小儿体外循环发展五年的调查[J]. 中国体外循环杂志,2005,3(4): 195-198

6. Greeley WJ, Kern FH, Ungerleider RM, Boyd JL 3rd, Quill T, Smith LR, BaldwinB, Reves JG. The effect of hypothermic cardiopulmonary bypass and total circulatory arrest on cerebral metabolism in neonates, infants, and children. J Thorac Cardiovasc Surg. 1991 May;101(5):783-94.

7. Croughwell N, Smith LR, Quill T, Newman M, Greeley W, Kern F, Lu J, Reves JG. The effect of temperature on cerebral metabolism and blood flow in adults during cardiopulmonary bypass. J Thorac Cardiovasc Surg. 1992 Mar;103(3):549-54.

8. 朱德明，王伟，黄继红等. 体外循环中温度对小儿神经系统的影响[J]. 中国体外循环杂志, 2008, 6(4): 201-203