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组织工程血管基质的制备及保存
发布时间:2014-12-15      来源:
 

组织工程血管基质的制备及保存

池一凡,林明山,侯文明,孙忠东,孙龙,牛兆倬,孙勇,生伟

青岛市立医院  心脏外科  孙忠东,13853278191

 

【摘要】目的研究组织工程血管基质的制备方法及保存方法方法采用胰蛋白酶、低渗溶液化学除垢剂法处理胸主动脉来制备组织工程血管基质,标本作大体、光镜及扫描电镜、透射电镜观察,将制备的血管基质放入液氮中保存,3月后取出作扫描电镜观察 结果:经该法处理的血管细胞全部脱除,胶原纤维、弹性纤维无断裂,细胞外基质保持完好,液氮保存3月后扫描电镜观察与新鲜基质无明显差别结论 酶、低渗溶液化学除垢剂联合法是制备组织工程血管基质的较好方法,制备的血管基质可放入液氮中作短期保存

 

【关键词】:组织工程血管基质除垢剂

 

目前应用组织工程技术制备血管移植材料是血管移植手术研究的热点。组织工程血管的制备主要包括血管支架材料的研制、体外细胞培养1和种植。可以用作为组织工程血管的支架材料主要有体内可降解的人工合成材料和天然组织中制备获得的材料。前者如聚乙二醇酸、聚丙醇酸等,有较好的生物相容性、可塑性和可降解性,但其工艺复杂。后者如血管脱细胞组织基质因含有特殊氨基酸序列等,可促进细胞吸附或保留分化功能因此作为天然生物支架材料逐渐受到人们重视。本实验通过采用酶、低渗溶液和化学除垢剂相结合的方法制备主动脉组织工程血管基质并将其保存于液氮中3取标本作扫描电镜观察为脱细胞血管基质的制备和保存并进一步应用于临床提供实验依据

 

材料和方法

1.材料与试剂:2月龄雄1体重1.5kg,由青岛市实验动物和动物实验中心提供,SCXK()200100100.125%胰蛋白酶(Sigma公司)1TritonX-100(Sigma公司)0.01%十二烷基硫酸钠 (SDS, Sigma公司)、磷酸盐缓冲液(Sigma公司)Hank’s(Sigma公司)。仪器:SW-CJ-2FB超净工作台(苏州净化仪器厂)、DDHZ-300型恒温震荡器(太仓市实验设备厂)、XTU-10C光学显微镜(上海豫光仪器有限公司)、JSM-840扫描电镜(日本JEOL公司)、JEM-1200EX透射电镜(日本JEOL公司

2实验方法:动物血管基质的制备2:无菌条件开胸,取其胸主动脉,10 cm,直径0.30.4cm,置入培养皿中,加入Hank’s液冲洗干净,用眼科剪、镊剥去外层结缔组织、轻柔剥除外膜。将获取的血管放入15ml离心管中,处理过程如下:加入含双抗的0.125%胰蛋白酶6~8 ml,作用4 h,然后用磷酸盐缓冲液冲洗3次,无菌去离子水作用12小时, 1%TritonX-100溶液作用24小时,磷酸盐缓冲液冲洗3次,无菌去离子水作用4h,最后用0.01%十二烷基硫酸钠作用24h,磷酸盐缓冲液冲洗3次,含双抗的Hank’s液冲洗4h后保存。以上步骤均在37℃恒温震荡器中持续振荡。

HE染色:制取的血管用体积分数为10%甲醛固定,作H-E染色,观察细胞脱除情况

电镜观察:制取的血管用体积分数为2%戊二醛固定作扫描电镜、透射电镜观察细胞脱除情况及胶原纤维和弹性纤维情况。

保存: 并将血管基质保存于液氮中3标本体积分数为2%戊二醛固定作扫描电镜观察与新鲜标本有无差别

 

结果

1大体观察结果血管剥除外膜后,管壁弹性良好,管腔无塌陷,内膜面光滑完整。脱细胞处理后,呈乳白色,管壁无破损,管腔无塌陷。

2. HE染色观察新鲜血管H-E染色石蜡切片血管壁中有大量核被蓝染的细胞存在,清晰可见胶原纤维亮红色,呈波浪状平行排列,见图1(A)。血管脱细胞组织基质H-E色光镜观察,可见脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维保持原来的形态和结构,呈网状排列,细胞已全部去除,见图1(B,C)。

图    1

A:新鲜血管壁(100×)    B组织工程血管质(100×)   C:组织工程基血管质(200×)

图1 兔血管组织脱细胞前后苏木精-伊红染色结果

3扫描电镜、透射电镜观察血管脱细胞组织基质扫描电镜观察,可见基质的基底膜面光滑完整,波浪状排列,无破裂图2( A),弹性纤维结构完整,为网状排列,孔径20-30μm×40-50 μm,见图2(B)。透射电镜下可见胶原纤维横纹 ,纤维无断裂,见图2(C)

 

图     2

A:×400,Bar=50μm,基质基底面波浪状排列,结构完整,无断裂   B:×400,Bar=50μm,弹性纤维成网状排列,纤维无断裂  C:×30000, Bar=200nm,射电镜下组织工程血管基质结构,可见胶原纤维横纹

图2 扫描透射电镜下血管脱细胞组织基质形态

4液氮保存3月后作扫描电镜观察可见胶原纤维结构完整,成网状排列,胶原纤维及弹性纤维无断裂现象,孔径与新鲜组无明显差别.图3(A,B)

A:液氮保存3月后基质扫描电镜(400×),与新鲜基质无明显差别  B:新鲜基质扫描电镜(100×)  

图3液氮保存组与新鲜组扫描电镜对比

讨论             

合适的支架材料对于构建组织工程血管十分重要,组织工程血管基质是采用动物血管,经脱细胞处理后获得的一种生物材料,它不仅去除了血管原有的免疫原性,保持了血管的原有形态和物理性能,而且保存了细胞识别的结合位点,易于种子细胞的种植和吸附3目前, 血管脱细胞组织基质已应用于膀胱、骨、软骨4的重建。1990,Wilson[5]应用除垢剂-酶联合提取法将狗颈总动脉进行处理,制备出ACTM支架,经多步骤的脱细胞处理,组织中的可溶性蛋白及细胞成分被除去,保留下来的是具有完整外观形态和组织学及超微结构的不可溶成分,主要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡聚糖、结构蛋白等。脱细胞的方法主要有酶消化法和去污剂法。我们采用两种方法的结合处理胸主动脉。先用胰酶对血管壁中的某些基质进行溶解和对细胞的完整性加以破坏,然后用低渗溶液进一步导致细胞溶胀、破裂。有文献表明6仅用0.03%SDS就能将心脏瓣膜中的细胞完全除去,且胞外基质保存完好,而且Rieder的研究也表明使用0.1%SDS制备的脱细胞血管基质由于细胞毒性过大,细胞根本无法在上面存活,因此本实验采用TritonX-100 0.01%SDS联合脱细胞的方法,以求完全脱除细胞和做大程度的降低SDS的细胞毒性本实验将TritonX-100 放在十二烷基硫酸钠之前,是因为十二烷基硫酸钠为离子型去垢剂,脱细胞效果强,短时间内大量细胞破裂后释放的蛋白酶较多,从而引起较多的蛋白纤维损伤,影响血管的结构和力学特性,故让柔和的非离子型去垢剂Triton X-100先去除部分细胞及内在的蛋白酶,使细胞内的蛋白酶不至于短时间内大量释放,降低胶原纤维、弹力纤维的损伤7 TritonX-100通过其上的亲水基团而溶解细胞膜,清除部分蛋白酶,最后用十二烷基硫酸钠进一步脱除细胞。血管经酶和去垢剂处理后,将细胞和可溶性蛋白质去除,提供了无抗原的胶原、弹力纤维和糖氨聚糖组成的细胞外基质,它允许新细胞向内生长繁殖。实验结果证明细胞被彻底清除胶原纤维、弹性纤维排列正常结构完整。

本实验通过使用液氮保存组织工程血管基质,可以为临床上争取充足的时间培养种子细胞和细胞种植联合培养,不受取材时间的限制,收治病人可随时择期手术,并且具有①合适的三维多孔且内部贯通的网络结构以适应细胞的生长、养分的输送和代谢产物的排放。②良好的生物相容性和表面活性。③良好的细胞亲和性,合适的表面化学以适合细胞附着,增殖和分化。④不引起机体的免疫排斥反应。⑤具有良好的可塑性和机械强度。⑥材料来源广泛,易于快速加工、灭菌、消毒等优点,备受广大外科临床工作者的青睐。

 

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