孙忠东，池一凡，侯文明，孙龙，牛兆倬，孙 勇，生伟，林明山  
青岛大学医学院附属青岛市立医院心外科,青岛266071

[摘要] 目的 探讨钙预处理对未成熟心肌的影响。方法 采用Langendorff离体灌注模型，分为3组：缺血再灌组（I/R）：离体心脏灌注10min、工作心15min后停灌45min恢复灌注15min，转为工作心模型30min；心脏缺血预处理组(IPC)，离体灌注10min 转为工作心15min，反复2次缺血5min/再灌5min，停灌45min后恢复灌注15min，转为工作心模型30min；钙预处理（CP）组：离体心脏灌注10min、工作心15min后，反复3次45秒无钙KH液灌流/5minKH液灌流，停灌45min后恢复灌注15min，转为工作心模型30min。以血流动力学指标、生化指标和心肌超微结构作为观察指标。结果 CP 、IPC 组在心功能恢复、三磷酸腺苷含量（ATP）、超氧化物歧化酶活性方面均优于I/R 组(P<0.05)，心肌含水量、丙二醛含量、心肌肌酸激酶和乳酸脱氢酶漏出率方面均低于I/R组(P<0.05)，心肌线粒体Ca2+-ATP酶活性、心肌线粒体合成ATP的能力均优于I/R 组(P<0.01)，心肌细胞内Ca2+含量、心肌线粒体Ca2+含量低于I/R 组(P<0.01)，心肌超微结构损伤较I/R 组明显减轻。结论　钙预处理对未成熟心肌具有明显保护作用。

Ca2+是经典PKC激活所必需的重要的内源性刺激剂[1]，未成熟心肌缺乏隔离与释放Ca2+的能力，更多的依赖于细胞外Ca2+来进行兴奋-收缩耦联。短暂的无Ca2+复Ca2+灌流离体成熟心脏可减轻随后的Ca2+反常所致的心肌损伤，这一现象被Ashraf称为Ca2+预处理(Ca2+ preconditioning,CP)[2]，其作用等同于心肌缺血预处理。未成熟心肌具有明显不同于成熟心肌的结构和功能特点，探讨对未成熟心肌的保护方法具有重要临床意义[3,4]。我们以幼兔Langendorff模型检验CP对未成熟心肌的作用。

材料与方法

1动物模型的建立：新生日本长耳大白兔腹腔注射20%乌拉坦（1g/kg）麻醉。气管切开插管呼吸机维持呼吸。开胸，右心耳注入肝素（300IU/kg），切开主动脉插入灌注管，即行Langendorff灌流，灌注压为6kPa（45mmHg）。切取心脏，结扎肺静脉，剪开左心耳将内径3mm左房灌注管插入左心房，内径1mm测压管插入左心室。灌注15min后转为工作心模型15min，左心房灌注压为1kPa（7.5mmHg），左心室后负荷为3kPa（22.5mmHg）。停止灌注45min（停灌期间温度保持在37℃）后恢复灌注15min，随后转为工作心模型30min。KH 缓冲液成分（mmol/L）:NaCl 118.5, KCl 4.70,CaCl2 2.50, MgSO4 1.20, NaHCO3  25.00, KH2PO4 1.20, Glucose 11.10,Na2EDTA 0.50。使用时新鲜配制，经0.45μm 滤器过滤，灌流前给予体积分数为95%O2和5%CO2混合气体按1.5L/min向储液瓶内的灌流液中通气30min，灌流液维持在37℃，pH为7.4，渗透压为320~330mOsm/L。

2动物分组及方法：出生14~21天的健康新生长耳大白兔18只，随机分为3组：缺血再灌组（I/R，n=6），建立Langendorff灌注模型，灌注10min、工作心15min，全心停灌45min后恢复灌注15min，转为工作心模型30min；心脏缺血预处理组(IPC)，离体灌注15min 转为工作心15min，反复2次缺血5min/再灌5min，然后重复I/R组缺血再灌注方法；Ca2+预处理组（CP组，n=6）：停灌前反复3次45S无钙KH液灌流/5minKH液灌流，然后重复I/R组缺血再灌注方法。

3测定指标：心脏跳动稳定后，记录心率（HR）、主动脉流量（AF）、冠状动脉流量（CF）、心排出量（CO）、左室收缩末压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）。以持续停灌前工作心基础水平为100%，比较复灌末心功能恢复的百分率。实验结束后取标本测心肌含水量（MWC）、心肌肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）15 min漏出率、 心肌组织三磷酸腺苷（ATP）含量（荧光素酶法）、超氧化物歧化酶（SOD）活性与丙二醛（MDA）含量（化学比色法，试剂盒购自南京聚力生物工程研究所）、心肌细胞内Ca2+含量、心肌线粒体Ca2+-ATPase活性及其Ca2+含量、心肌线粒体合成ATP能力[ATP]m和心肌超微结构。

4.统计学方法：数据以均数±标准差（±S）表示，利用Excel统计软件对数据进行方差分析。P<0.05具有统计学差异显著性。

结  果

1 血流动力学指标（表1）：IPC、CP组与I/R组比较，HR、AF恢复率差异无统计学意义（P>0.05），CF、CO、LVSP和LVEDP差异有统计学意义（P<0.05）。

2生化指标（表2~4）：IPC、CP组与I/R组比较，MWC差异有统计学意义（P<0.05）；LDH 、CK漏出率、ATP含量、MDA含量、SOD活性、心肌细胞内Ca2+含量、心肌线粒体Ca2+-ATPase活性及其Ca2+含量、心肌线粒体合成ATP能力差异有统计学意义（P<0.01）。

3心肌超微结构：I/R组（图1）：线粒体肿胀明显，部分呈空泡状融合并溢出细胞外，线粒体嵴溶解明显；肌丝排列紊乱、溶解。IPC组（图2）：线粒体轻度肿胀，部分线粒体嵴密度增高；肌丝排列较整齐，偶见局灶性肌丝排列紊乱、溶解。CP组（图3）：线粒体轻度肿胀，偶见少量线粒体呈空泡状；肌丝排列整齐，无明显溶解。

讨  论

未成熟心肌的钙通道发育不完善，其密度及活性明显低于成熟心肌[5]，钙通道对成熟心肌胞浆游离Ca2+的调节作用比未成熟心肌重要。细胞内Ca2+主要是贮存于内质网（ER）/肌浆网（SR）内。未成熟心肌SR的含量低，发育差、稀疏，钙泵活性低， Ca2+-ATPase活性低,摄Ca2+能力差。因此，SR对未成熟心肌的Ca2+调节作用较成熟心肌差[6]，更多依赖于细胞外Ca2+。未成熟心肌细胞兴奋时所需的Ca2+主要靠细胞外Ca2+内流提供，细胞内游离Ca2+浓度的调节主要是通过Na+/Ca2+交换来完成[7]。因此可以认为，对于未成熟心肌，调控肌膜Na+/Ca2+交换是缺血/再灌注期间控制心肌细胞内Ca2+浓度的重要机制。

我们的实验通过建立动物Langendorff灌注模型，比较了钙预处理和心脏缺血预处理对缺血/再灌(I/R)未成熟心肌的效应，结果显示：与I/R组相比，钙预处理和心脏缺血预处理组在再灌注期间，左心室的舒缩功能明显改善，LDH、CK的漏出率及MDA含量减少，心肌水肿减轻，ATP和SOD活性增高，心肌超微结构损伤轻于I/R组，证实钙预处理和心脏缺血预处理对未成熟心肌功能和形态结构具有等同的保护效应，二者之间无明显差异；同时钙预处理和心脏缺血预处理组心肌细胞内、线粒体内Ca2+含量减少，线粒体ATP合成能力和心肌线粒体Ca2+ -ATPase活性较I/R组明显增加，表明钙预处理和心脏缺血预处理一样可以减轻细胞内和线粒体内钙超载而发挥其细胞保护效应[10]。

钙预处理对未成熟心肌保护作用的机制，可能与PKC激活和线粒体Ca2+敏感性钾通道需要Ca2+参与相关[8-10],其具体的机制有待于进一步阐明。