孙忠东，池一凡，侯文明，孙龙，牛兆倬，孙 勇，生伟，林明山  
青岛大学医学院附属青岛市立医院心外科,青岛266071

摘要：目的  探讨Ca2+预处理对未成熟心肌细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。方法 新生长耳大白兔12只，随机分为2组，常规建立Langendorff模型，缺血再灌注组(I/R)：灌注20 min后，停灌45 min，复灌120 min；钙预处理组(CP)：灌注KH液20 min，反复3次45秒无钙KH液灌流/5minKH液灌流，停灌45 min，复灌KH液120 min。以凋亡细胞原位标记与半定量分析、琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段梯、bcl-2、bax、fas蛋白的表达作为测定指标。结果 CP组与I/R组比较，心肌细胞凋亡率明显减少(P<0.01)，琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段梯光密度明显减少(P<0.01)， bcl-2表达明显增多(P<0.01)，bax、fas表达明显减少(P<0.01)。结论 Ca2+预处理影响bcl-2、bax、fas蛋白的表达,减少心肌细胞凋亡。


心肌细胞损伤的过程是通过一系列钙敏感性信号转导所介导的[1]。Ca2+超载可导致细胞凋亡的发生， Ca2+预处理对细胞凋亡和凋亡相关蛋白的作用尚未可知，本实验的目的是观察Ca2+预处理对细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。

1 材料和方法
1.1  实验动物
出生14~21d日本长耳大白兔12只（华中科技大学同济医学院动物室提供），体质量230~300g，雌雄不拘。
1.2  动物模型的建立和分组
新生日本长耳大白兔腹腔注射20%乌拉坦（1g/kg）麻醉。气管切开插管呼吸机维持呼吸。开胸，右心耳注入肝素（300IU/kg），切开主动脉插入灌注管，即行Langendorff灌流，灌注压为6kPa（45mmHg）。切取心脏，结扎肺静脉，剪开左心耳将内径3mm左房灌注管插入左心房，内径1mm测压管插入左心室。灌注15min后转为工作心模型15min，左心房灌注压为7.5mmHg，左心室后负荷为22.5mmHg。停止灌注45min（停灌期间温度保持在37℃）后恢复灌注15min，随后转为工作心模型30min。KH 缓冲液成分（mmol/L）:NaCl 118.5, KCl 4.70,CaCl2 2.50, MgSO4 1.20, NaHCO3  25.00, KH2PO4 1.20, Glucose 11.10,Na2EDTA 0.50。使用时新鲜配制，经0.45μm 滤器过滤，灌流前给予体积分数为95%O2和5%CO2混合气体按1.5L/min向储液瓶内的灌流液中通气30min，灌流液维持在37℃，pH为7.4，渗透压为320~330mOsm/L。
12只幼兔按随机数字法分为2组，每组6只。；缺血再灌注组(I/R，n=6) 灌注20min后，停灌45min，复灌120min；钙预处理组(CP，n=6) 灌注20min后反复3次45秒无钙KH液灌流/5minKH液灌流，停灌45min，复灌120min。
1.3  观察指标和检测方法
①凋亡细胞原位标记与半定量分析  左心室心肌组织常规石蜡包埋，采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT酶)介导的带荧光的deuridine triphosphate(dUTP)缺口末端标记法(terminal transferase UTP nick end labeling,TUNEL)标记凋亡细胞核中DNA3´-OH末端，经脱蜡，洗脱，消化，孵育，洗脱， 二氨基联苯胺(DAB)显色，镜下观察。根据凋亡阳性细胞分布情况，每张切片拍摄5个阳性视野，每视野计数300个心肌细胞中阳性细胞数，以平均计算阳性细胞所占的百分比作为凋亡细胞阳性指数(AI)。②琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段梯  采用快速法检测DNA片段梯。③Bcl-2、bax、fas表达  采用Western blot法。
1.4  统计学分析
计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，统计学方法采用方差分析，组间比较采用q检验，采用NoSA V2.30统计软件进行统计处理。

2  结 果
2.1  凋亡细胞原位标记与半定量分析（表 1，图1-2）
    CP组的细胞凋亡率为4.53±1.22，与I/R组的12.30±2.12比较P<0.01，具有显著性差异。
2.2  琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段梯（图3）
     CP组DNA片段梯与I/R组比较明显增强，用MPIAS-1000型多媒体病理图象分析系统进行光密度测定，CP与I/R组比较P<0.01，具有显著性差异。
2.3 Bcl-2、bax、fas表达（图4～6）
     Bcl-2表达：bcl-2在I/R组有少量表达，光密度测定（MPIAS-1000型多媒体病理图象分析系统）二者无明显差异；在CP组bcl-2表达明显增多，与I/R组比较（光密度）P<0.01，具有显著性差异。
     Bax表达：bax在I/R组有大量表达，在CP组bax表达明显减少，CP组与I/R组比较（光密度）P<0.01，具有显著性差异。
     Fas表达：fas在I/R组有大量表达，在CP组fas基因蛋白表达明显减少，CP与I/R组比较（光密度）P<0.01，具有显著性差异。

3 讨论
早期大量的实验证明，多种刺激因子作用于不同细胞诱导凋亡的过程伴随胞质Ca2+的持续升高，以无Ca2+培养基或通过其它方法抑制细胞内Ca2+升高可以抑制细胞凋亡的发生。Kluck等[2]提出的细胞Ca2+平衡的破坏决定细胞凋亡的假说已经普遍被接受。但是，胞质Ca2+升高或Ca2+降低导致的失衡是否以共同的下游途径诱导细胞凋亡，还有待于深入研究。
细胞凋亡是一个精细的调节过程, 已知有多种蛋白参与了凋亡调控。PKC 作为一组具有单一肽链结构的丝氨酸/苏氨酸 (Ser/Thr) 蛋白激酶，在心肌细胞凋亡通路中起着承上启下的作用[3]。各种应激可通过线粒体依赖途径介导心肌细胞凋亡, 该途径受Bcl-2家族蛋白调控。Bcl2家族位于线粒体的上游，包括促凋亡及抗凋亡分子，参与细胞凋亡的调节[4]。研究表明, Bcl-2家族的蛋白表达与PKC的活化相关, 而活化后的PKC可在心肌缺血性损伤中对心肌细胞起到保护作用，而Ca2+与PKC的活化密切相关。本实验研究表明钙预处理可减少未成熟心肌细胞凋亡，上调bcl-2表达，下调bax、fas的表达来减少心肌细胞凋亡，可能与Ca2+导致PKC的活化启动心肌保护密切相关。
PT孔是线粒体的一种特殊的通透转变孔道， Ichas等[5]提出了钙依赖性的PT孔调节模型，认为PT孔有低导性和高导性两种不同的开放方式，两种开放方式均受线粒体Ca2+浓度的升高直接或间接调控。大量研究表明，PT孔在Ca2+依赖性的细胞凋亡中通过线粒体膜电位（△ψm）崩溃、大量Ca2+和凋亡诱导相关蛋白释放等多种方式调控细胞凋亡[6]。另外细胞核Ca2+在细胞凋亡中的作用近来日益备受关注。研究表明，细胞核存在独立完整的Ca2+转移系统，调节或接受细胞凋亡过程的Ca2+信号，细胞核Ca2+也可能参与细胞凋亡的过程[7]。
细胞凋亡的信号通路是一个复杂的网络调控系统，各因素之间相互作用，相互交织。细胞钙离子稳态失调是凋亡过程中普遍存在的一个生化事件，线粒体作为凋亡信号通路的核心，目前对线粒体内Ca2+变化机制还不是很清楚，本实验研究表明，Ca2+介导的信号通路参与了心肌细胞凋亡的发生和凋亡相关蛋白的表达，可能是Ca2+预处理发挥心肌保护作用的机制之一[8]。