孙忠东，池一凡，侯文明，孙龙，牛兆倬，孙 勇，生伟，林明山 
青岛大学医学院附属青岛市立医院心外科,青岛266071

    摘要: 目的 探讨蛋白激酶C在未成熟心肌预处理保护中的作用。方法 建立兔Langendorff灌注模型，将24只幼兔随机分为4组：缺血/再灌注组（I/R组）：灌注15min转为工作心15min，停灌45min，恢复灌注15min改为工作心30min；心脏缺血预处理组（MIP组）：灌注15min转为工作心15min，反复2次缺血5min再灌注5min，重复I/R组停灌再灌注方法；蛋白激酶C（PKC）阻滞组(CLT组)：灌注15min转为工作心15min，灌注含CLT的KH液20min，反复2次停灌5min/复灌5min，重复I/R组停灌再灌注方法；PKC激活剂组(PKC组)：灌注15min转为工作心15min，灌注含蛋白激酶C的特异性激活剂佛波酯(PMA) 0.01nmol/L 5min，重复I/R组停灌再灌注方法。以血流动力学、生化指标、心肌超微结构等作为观察指标。结果 MIP和PKC组心功能恢复、心肌含水量优于I/R和CLT组(P<0.05)，三磷酸腺苷含量、超氧化物歧化酶活性、心肌线粒体Ca2+-ATPase活性、心肌线粒体合成三磷酸腺苷(ATP)的能力优于I/R和CLT组(P<0.01)，丙二醛含量、血清肌酸激酶和乳酸脱氢酶漏出率、心肌细胞内Ca2+含量、心肌线粒体Ca2+含量低于I/R和CLT组(P<0.01)，心肌超微结构损伤较I/R和CLT组明显减轻。结论 心肌缺血预处理对未成熟心肌具有明显的保护作用，其机制可能是通过PKC的激活和mitoKATP通道的开放起作用。
              
    蛋白激酶C(PKC)由一个丝氨酸/苏氨酸酶家族组成,在细胞信号传导中发挥重要作用，研究表明，在成熟心肌PKC激活在心肌缺血预处理（MIP） [1]和心肌细胞成长中起重要作用[2]。目前,多数学者认为PKC的活化是缺血预适应的共同途径[3，4]。本实验采用幼兔离体心脏Langendorff灌注模型，探讨MIP对未成熟心肌心肌保护作用及其机制是否通过PKC而起作用，从而为未成熟心肌非创伤性预处理特别是药物预处理和临床应用提供实验依据。

1材料与方法

    1.1  实验动物
    出生14~21d日本长耳大白兔24只（华中科技大学同济医学院动物室提供），体质量230~300g，雌雄不拘。
    1.2  动物模型的建立和分组
    新生日本长耳大白兔腹腔注射20%乌拉坦（1g/kg）麻醉。气管切开插管呼吸机维持呼吸。开胸，右心耳注入肝素（300IU/kg），切开主动脉插入灌注管，即行Langendorff灌流，灌注压为6kPa（45mmHg）。切取心脏，结扎肺静脉，剪开左心耳将内径3mm左房灌注管插入左心房，内径1mm测压管插入左心室。灌注15min后转为工作心模型15min，左心房灌注压为7.5mmHg，左心室后负荷为22.5mmHg。停止灌注45min（停灌期间温度保持在37℃）后恢复灌注15min，随后转为工作心模型30min。KH 缓冲液成分（mmol/L）:NaCl 118.5, KCl 4.70,CaCl2 2.50, MgSO4 1.20, NaHCO3  25.00, KH2PO4 1.20, Glucose 11.10,Na2EDTA 0.50。使用时新鲜配制，经0.45μm 滤器过滤，灌流前给予体积分数为95%O2和5%CO2混合气体按1.5L/min向储液瓶内的灌流液中通气30min，灌流液维持在37℃，pH为7.4，渗透压为320~330mOsm/L。
24只幼兔按随机数字法分为4组，每组6只。I/R组：建立Langendorff模型，灌流10min、工作心15min后，全心停灌45min，恢复灌注15min，工作心30min；MIP组：建立Langendorff模型，灌流10min、工作心15min，反复2次停灌5min/复灌5min，全心停灌45min，恢复灌注15min、工作心30min；CLT组：建立Langendorff模型，灌流10min、工作心15min，灌注含CLT(0.8mmol/L，Sigama产品)的KH液20min，反复2次停灌5min/复灌5min，全心停灌45min，恢复灌注15min、工作心30min；PKC组：建立Langendorff模型，灌流10min转为工作心15min，灌注含蛋白激酶C的特异性激活剂佛波酯(PMA)( 0.01nmol/L，Sigama产品)5min，全心停灌45min，恢复灌注15min、工作心30min。。
    1.3  观察指标和检测方法
    心脏跳动稳定后，记录心率（HR）、主动脉流量（AF）、冠状动脉流量（CF）、心排出量（CO）、左室收缩末压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）。以持续停灌前工作心基础水平为100%，比较复灌末心功能恢复的百分率。实验结束后取标本测心肌含水量（MWC）、心肌肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）15 min漏出率、 心肌组织ATP含量（荧光素酶法）、SOD活性与MDA含量（化学比色法，试剂盒购自南京聚力生物工程研究所）、心肌细胞内Ca2+含量、心肌线粒体Ca2+-ATPase活性及其Ca2+含量、心肌线粒体合成ATP能力[ATP]m和心肌超微结构作为观察指标。
    1.4  统计学分析
    计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，统计学方法采用方差分析，组间比较采用q检验，采用NoSA V2.30统计软件进行统计处理。

2结   果

    2.1 血流动力学指标（表1）：
MIP和PKC组与I/R和CLT组比较，HR、AF恢复率无差异性（P>0.05），CF、CO、LVSP和LVEDP有显著差异性（P<0.05）；MIP和PKC组比较无差异性（P>0.05），I/R和CLT组之间比较无差异性（P>0.05）。
    2.2生化指标（表2~4）：
    MIP和PKC组与I/R和CLT组比较，MWC有显著差异性（P<0.05）；LDH 、CK漏出率、ATP含量、MDA含量、SOD活性、心肌细胞内Ca2+含量、心肌线粒体Ca2+-ATPase活性及其Ca2+含量、心肌线粒体合成ATP能力MIP和PKC组与I/R和CLT组比较有显著差异性（P<0.01）。
2.3心肌超微结构。
    I/R组（图1）：线粒体肿胀明显，部分呈空泡状融合并溢出细胞外，线粒体嵴溶解明显；肌丝排列紊乱、溶解。
    MIP组（图2）：线粒体轻度肿胀，部分线粒体嵴密度增高；肌丝排列较整齐，偶见局灶性肌丝排列紊乱、溶解。
   CLT组（图3）：线粒体明显肿胀，部分呈空泡状融合并溢出细胞外，线粒体嵴溶解；肌丝排列紊乱、溶解。
    PKC组（图4）：线粒体轻度肿胀，部分线粒体嵴密度增高；肌丝排列较整齐。

3 讨  论

    近来随着对心肌保护整体性的认识和未成熟心肌保护的重视，缺血预处理对未成熟心肌保护作用及机制的探讨逐渐引起学者们地重视。MIP诱导内源性介质的释放与受体结合，经历胞外信息向胞内传递过程中，涉及复杂的信号传导。蛋白激酶C是心肌细胞磷脂酰肌醇信号转导系统的重要组成部分。PKC活化的胞外信号主要是通过磷脂酶系统传入胞内，PKC通过磷酸化位于细胞膜和胞浆内的多种蛋白质而发挥调节心肌细胞代谢和生理功能[5,6]。
    MIP导致内源性介质释放与受体结合，经信号传导最终达效应子发挥MIP保护心肌的功能。PKC激活后使之从胞质转位至胞膜使胞膜上的ATP依赖的K离子通道(KATP)开放,通道传导性增加,K+外流,Ca++内流减少,使动作电位时程缩短,减少ATP消耗,保护心肌细胞，PKC的激活可能是MIP中的中心环节[3]。KATP的活性受很多代谢因素和药物的调控，其中PKC在mitoKATP调节中起重要作用。MIP时PKC的激活可磷酸化mitoKATP通道使mitoKATP通道开放[1,6-7]，K+内流，膜去极化，减轻线粒体内Ca2+超载, 基质容积增加，后者可增加ATP合成，促进线粒体呼吸，从而发挥心肌保护作用。
    本实验通过建立Langendorff离体灌注模型，检验了PKC激活和MIP对未成熟心肌具有相同的的保护作用，实验结果表明：应用PKC阻滞剂CLT可取消MIP对未成熟心肌的保护作用；应用PKC激活剂PMA预处理未成熟心肌可模拟MIP的保护效应，说明MIP对未成熟心肌的保护机制是通过PKC起作用。
    蛋白激酶C是缺血预处理和心肌保护的一个关键的“中介子”， 它通过磷酸化众多位于膜上和胞质内的底物蛋白包括离子通道、受体、酶、细胞骨架蛋白等而发挥广泛的生理作用，调节细胞的代谢和生理功能。我们的研究表明，PKC是MIP的中心环节,外源性因子可以激活PKC，使之产生内源性保护作用[8-10]，PKC被激活后如何调控它的下游信号通路需要进一步的研究[11-12]。