池一凡,林明山,侯文明,牛兆倬,孙勇, 孙忠东,孙龙,生伟

青岛市立医院心脏外科

【摘要】目的：探索不同细胞密度种植构建组织工程血管的方法。方法：采用两步法进行细胞种植，先将不同密度血管平滑肌细胞种植在脱细胞血管基质上，培养3天后再将不同密度内皮祖细胞接种在平滑肌细胞一血管基质复合体上，构建片状组织工程材料，分别在内皮祖细胞种植后3d、1w时间段获取标本，2%戊二醛固定，扫描电镜观察，MTT法检测不同密度细胞的生长情况。结果:种子细胞(SMCs和EPCs)在脱细胞基质表面生长良好。不同密度细胞种植，细胞在基质上的排布不同；提高接种的密度有利于在材料表面快速形成致密的细胞层。结论：可采用两步法以合适的密度种植细胞于脱细胞血管基质上，构建组织工程血管。

关键词：组织工程血管；内皮祖细胞；平滑肌细胞；脱细胞血管基质；种植

   　随着材料科学、工程科学、生物科学等相关学科的发展，应用组织工程学技术构建工程化血管表现出强烈的可探索性。正常血管组织中，胶原蛋白、弹力蛋白、蛋白聚糖、透明质酸等大分子物质为主的细胞外基质，将平滑肌细胞及成纤维细胞包绕，形成中膜基本结构；内皮细胞层覆盖于血管内腔面。构建组织工程血管，是在体外模仿血管解剖结构，进行种子细胞种植和三维培养。我们将体外培育的种子细胞及制备的脱细胞血管基质［1］作为研究对象，将不同密度细胞种植脱细胞血管基质上，初步观察组织工程血管构建的方法。

材料与方法

1．材料：平滑肌细胞，内皮祖细胞，脱细胞血管基质［2-3］

2.实验方法：脱细胞血管基质剪为10.0㎜×10.0㎜大小，片状，以PBS清洗3-5次，放入6孔培养板并加入含20%胎牛血清的DMEM中平衡24h，定时换液，测定PH为7.0-8.0，放入37℃、C02细胞培养箱中保存。

收集活性较好的第4代平滑肌细胞，按细胞密度5×102个/ml 和5×104个/ml制成细胞悬液。分别种植于6孔培养板和预处理的脱细胞血管基质外表面，每孔的细胞悬液为0.5ml，37℃细胞培养箱中静置3h，加入5mlDMEM培养液培养。

三天后，更换培养板，收集培养的外周血内皮祖细胞，制成细胞密度5×102个/ml 和5×104个/ml的细胞悬液。各取0.5ml细胞悬液，种植于6孔培养板含有不同密度平滑肌细胞的脱细胞血管基质内表面，37℃细胞培养箱中静置1.5h，加入5mlDMEM培养液培养。种植细胞后的血管，37℃细胞培养箱中培养，2天换液一次。

组织工程血管的观察

1.MTT法测定平滑肌细胞和内皮祖在6孔培养板和脱细胞血管基质上的生长曲线:6孔板的每孔中加入200 u1的5mg/ml的MTT溶液，4个小时后吸去上清，加入200u1的DMSO，振荡8-10分钟后将液体转入96孔板，每孔各加200ul,490nm测吸光值，连续测8天，以吸光值绘制曲线。

2.使用Image-Pro图像分析软件对电镜图像进行分析，分析不同细胞不同密度种植时的覆盖率的情况。

3.在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并在种植内皮祖细胞后3d、1w时间段获取标本，2%戊二醛固定，扫描电镜观察。

结果

1.生长曲线：第4代的SMCs生长状况良好，细胞在孔板上和基质上的增殖曲线较为相似，细胞增殖比较平缓，4-5天都到达峰值，但脱细胞基质上的吸光值略低于孔板（图1）。EPCs在孔板上和平滑肌细胞－脱细胞基质复合物上的吸光值与SMCs的实验结果相似，细胞增殖较为缓慢，6-7天达到峰值，细胞在基质的吸光光度值略低于在孔板的吸光光度值（图2）.

图1: SMCs在孔板上和在脱细胞基质上的生长曲线

图2: EPCs在孔板上和细胞-基质复合物上的生长曲线

2.覆盖率：SMCs单独培养时，高密度(5×104个/ml)种植细胞的覆盖率明显高于低密度(5×102个/ml)种植细胞，这种差异在种植后2d和5d一直存在(图3)。低密度(5×102个/ml)和高密度(5×104个/ml)EPCs种植在含有高密度SMCs的脱细胞基质组，覆盖率均显著高于种植在含有低密度SMCs的脱细胞基质组(图4-5)。

图3: 不同种植密度的SMCs在脱细胞基质上的覆盖率(%)

1: 5×102个/ml           2: 5×104个/ml

  图4: 低密度（5×102个/ml）EPCs种植在含有不同密度SMCs的脱细胞基质上的覆盖率(%)

1: 含有低密度（5×102个/ml）的SMCs脱细胞基质

2: 含有高密度（5×104个/ml）的SMCs脱细胞基质

图5: 高密度（5×104个/ml）EPCs种植在含有不同密度SMCs的脱细胞基质上的覆盖率(%)

1: 含有低密度（5×102个/ml）的SMCs脱细胞基质

2: 含有高密度（5×104个/ml）的SMCs脱细胞基质

3.电镜观察：细胞种植前可见脱细胞血管基质表面的细胞成分已经被去除，支架内充满空隙，同时胶原纤维的结构保持完整(图6)。内皮祖细胞在材料上趋于扁平，当接种密度较低时(5×102个/ml)，细胞呈多角形，有一定的细胞连接，但细胞覆盖率较低，培养1w后，细胞的覆盖率没有明显的增加，细胞增殖较缓慢,覆盖率较低(图7)。高密度(5×104个/ml)种植的内皮祖细胞，3d后细胞表现出明显的铺路石样结构。1周后可见细胞排列紧密，局部融合成片，细胞覆盖率较高(图8)。

图6: 细胞种植前脱细胞血管基质电镜观察

A: ×2000                               B: ×2000

图7: 低密度种植EPCs后电镜观察

A：3天时，细胞呈多角形 ×2000　　　      B：1w后，细胞覆盖率仍较低 ×500

图8: 高密度种植EPCs后电镜观察

A：细胞呈铺路石样排列 ×500　　　　　 B：1w后，细胞局部融合成片×500

讨论

   制备一个理想的以脱细胞同种或异种血管基质为支架的组织工程血管，需要尽可能除去支架内的细胞成分,同时保持ECM的结构完整,另外支架的力学性能要尽可能接近天然组织。理想的替代血管应具有完整的内皮细胞层而不形成血栓栓塞；具有血管生物活性，能对温度、血流变化有相应舒缩反应，并能分泌相应的生物活性物质，同时，细胞成分的完整性也是必须的［4］，正常的生理血管的两个主要细胞成分为SMC和EC，两者之间通过一系列反馈系统，影响各自的基因表达和蛋白合成，它们之间平衡关系的维持是血管功能发挥正常的前提［5］，一些SMC和EC共培养的研究模型显示，SMC和EC共培养后，一些血管活性物质在两种细胞内的表达发明显生变化［6-7］，与EC共培养后SMC的VEGF,PDGF-BB,TGF-b基因表达和蛋白分泌得到加强，而bFGF表达下调；同样与SMC共培养后EC的VEGF表达也增强了。以上这些血管原性的基因表达和蛋白质合成正是维持血管正常功能所必须的。这些实验为组织工程血管支架表面的SMC和EC联合培养的必要性提供了理论依据。但是对组织工程领域而言，如何在平滑肌细胞层上成功获得致密的内皮细胞层是最为重要的。我们初步尝试在平滑肌细胞上接种内皮祖细胞，让其分化得到内皮细胞，以求获得较为致密的EC层。

在本实验中我们发现，SMCs在脱细胞血管基质上种植，低密度种植时细胞生长曲线与高密度种植时相似，并且种植在孔板上和种植在脱细胞基质上生长曲线亦相似，但低密度种植组增殖较慢，覆盖率较低。细胞种植在孔板上的吸光值较种植在脱细胞基质上高，SMCs在孔板上的吸光值峰值接近1.0，而在脱细胞基质上的只有0.7左右，EPCs吸光特点与SMCs相似，在孔板峰值为0.8，而在脱细胞基质基质上只有0.6。对细胞覆盖率进行分析显示，高密度种植SMCs的覆盖率明显高于低密度种植组。低密度EPCs种植于SMCs-脱细胞基质复合物上，复合细胞的覆盖率较单独SMCs时有所增高，但增高幅度不大。在低密度的SMCs-脱细胞基质复合物上种植时2天后增高约2%,5天时增高约3-4%；种植在高密度上2天时种植增高约6-7%,5天时增高约4-5%。高密度EPCs种植在低密度的SMCs-脱细胞基质复合物上2天时增高约5-6%,5天时增高达8%；种植在高密度的SMCs-脱细胞基质复合物上2天时增高达15%以上,5天时增高亦达10%左右。可以看出，高密度EPCs种植，其生长增殖速度，在支架上的覆盖率均高于低密度种植，可以较快的获得致密细胞层；同时，平滑肌细胞在基质上生长并分泌细胞基质后,有助于内皮祖细胞的黏附和生长,从而能够提高内皮祖细胞的种植效率。

低密度EPCs种植3d后，细胞呈多角形、长梭形，有一定的细胞连接，但细胞覆盖率较低；1w后，细胞形态没有明显变化，细胞的覆盖率稍有增加，但细胞增殖缓慢。高密度种植的EPCs在脱细胞基质上可以形成较为致密的细胞层，呈现出铺路石样生长方式，说明EPCs逐步分化为ECs，随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多，可见局部细胞融合成片，细胞排列更加紧密，并且可见有粘液样物质附着于脱细胞基质上。

本实验采用静态种植和静态培养的方法，这种方法比较简单易行，但是存在着不足：细胞静态种植和静态培养后粘附不紧密，在血流冲击下容易脱落，成活率较低；细胞缺少血流冲击，种植后生物活性低下。而动态种植和动态培养则是在模拟生理血流冲击的条件下种植细胞和培养细胞，这样细胞与组织粘附紧密，一旦粘附不易脱落，而且生物活性也较高。但动态种植和培养的方法繁琐，细胞开始不易粘附，而且要有模拟生理环境的生物反应器，其过程较为繁琐。

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