成果简介：
本研究利用SD大鼠作为研究对象开展了（1）骨质疏松症疾病动物模型构建研究：利用去除卵巢的方法成功构建SD大鼠骨质疏松症疾病动物模型，为开发治疗骨质疏松症的新型药物做铺垫。（2）SD大鼠脂肪细胞维生素D受体亚细胞定位研究：采用原位免疫荧光染色技术及荧光定量PCR技术所得试验结果可知维生素D受体在大鼠脂肪细胞中表达，为开发维生素D类创新型减肥药物打好坚实的物质基础。

成果内容提要：
主要观点：
维生素D (Vitamin D, VD) 是一种机体必需的脂溶性固醇类衍生物。机体内的VD主要由皮肤产生或从食物摄取，在肝脏羟基化为25-羟基维生素D（25(OH)D），这是VD的主要循环形式，其血清水平也是衡量体内VD含量的指标(Jones, 2009; Jones, 2008)。之后，25(OH)D在1α-羟基化酶（CYP27B1）的作用下形成VD的活性形式：1,25-羟基维生素D（1,25(OH)2D）。同时，24-羟基化酶（CYP24）催化1,25(OH)2D降解为无活性的代谢产物(Jones et al, 1998)。
1,25(OH)2D的经典作用是调节机体钙磷平衡和骨代谢。而目前越来越多的研究证明1,25(OH)2D还参与调节了一系列生理和病理过程，尤其是1,25(OH)2D缺乏与包括肥胖在内的诸多代谢综合症的发病有关(Barchetta et al, 2011; Vrieling et al, 2011; Osei, 2010)。临床研究显示，肥胖患者体内的25(OH)D水平较低(Fish et al, 2010; Khandalavala et al, 2010)。为肥胖患者补充VD药物，增加血清25(OH)D水平后，能有效减少内脏脂肪的沉积(Rosenblum et al, 2012; Caron-Jobin et al, 2011)。此外，体内1,25(OH)2D水平与肥胖患者的BMI和体脂量呈负性相关(Kayaniyil et al, 2011; Frost et al, 2010)。因此，1,25(OH)2D与脂肪组织的功能之间存在一定的相关性。
研究显示，脂肪组织可能参与了1,25(OH)2D的代谢过程。因为成熟的脂肪细胞能大量释放1,25(OH)2D，说明脂肪组织可能具有吸收25(OH)D，并将其转化为有活性的1,25(OH)2D的能力(Trayhurn et al, 2011)。然而，1,25(OH)2D对脂肪组织的影响却还有争论。一方面，1,25(OH)2D对脂肪细胞分化的作用存在分歧(Narvaez et al, 2013; Sakuma et al, 2013; Nimitphong et al, 2012)；另一方面，1,25(OH)2D还会影响脂肪因子的分泌(Kong et al, 2013; Mutt et al, 2012)，增加了1,25(OH)2D与脂肪组织互作的复杂性。另外，1,25(OH)2D是激活维生素D受体(Vitamin D Receptor , VDR)的配体。具有转录活性的VDR在细胞核内与视黄酸X受体(retinoid X receptor, RXR)形成二聚体(Issa et al, 1998)，结合于靶基因启动子区的维生素D反应元件上，直接或间接激活下游靶基因的表达，以介导细胞增殖、分化和凋亡，调节机体免疫和血管生成等各种生物学过程。由于VDR在组织细胞内的存在是研究1,25(OH)2D多种功能的理论基础(Wang et al, 2012; Wang & DeLuca, 2011; Plum & DeLuca, 2010)，因此检测VDR在脂肪细胞分化过程中的表达是本项目的研究内容之一。研究表明，超表达VDR会抑制3T3L1前体脂肪细胞的分化(Kong & Li, 2006)。但是，全身性敲除VDR的小鼠却表现出体脂减少的现象(Narvaez et al, 2009; Wong et al, 2009)。因此，有关VDR对脂肪细胞分化的作用及其方式，仍存有争论，需要进一步验证。
综上所述，鉴于脂肪组织在机体能量平衡、脂质代谢和炎症反应方面的重要性，本项目拟以体外培养的原代脂肪细胞为研究材料，采用荧光免疫组化法检测VDR在脂肪细胞分化过程中的表达变化，利用real-time qPCR和western blot研究原代脂肪细胞中VDR 的作用。为1,25(OH)2D预防和治疗肥胖提供理论依据，对机体的代谢健康有重要意义。
结论为大鼠不同部位的脂肪组织在形态学上具有一定的差异; VDR主要集中分布在大鼠脂肪细胞的细胞核 中; VDR基因在雌雄 SD 大鼠各个脂肪组织中的表达量不同，为脂肪细胞的分化以及 VDR的 功能研究奠定基础，为今后肥胖的发病与治疗提供理论依据。
创新点：
1 本研究通过手术的方法，去除雌性SD大鼠卵巢，从而成功构建大鼠骨质疏松症疾病动物模型，为新药研发做好铺垫。
2 本研究通过分离培养原代脂肪细胞，确定VDR在其分化过程中的表达规律，探讨VDR对原代脂肪细胞分化的影响。为进一步明确VDR在脂肪组织中的生物学功能奠定基础，也为VDR在脂肪细胞分化过程中的研究提供新的理论依据。
3建立原代脂肪细胞分离培养体系及超表达VDR脂肪细胞分化模型是本研究的关键技术。①原代脂肪细胞分离培养具有一套完整的操作流程，用该方法得到的原代脂肪细胞纯度较高，分化程度明显，能够保证实验的稳定性和重复性。②超表达VDR脂肪细胞分化模型，是通过化学转染的方法将pcDNA3.1-GFP-VDR质粒转染到原代脂肪细胞中，在转染24 h后添加G418进行筛选。经10-14 d的筛选可以获得稳定表达VDR的脂肪细胞。
实践意义：
该项目通过构建SD大鼠骨质疏松症疾病动物模型，为开发治疗骨质疏松症的新型药物做铺垫，并通过研究VDR对原代脂肪细胞分化作用的影响，阐述VDR作用于原代脂肪细胞的机制，一方面能够为肥胖的预防和治疗提供新的理论基础，另一方面也为验证1,25(OH)2D类似物的有效性提供对照模型和实验依据，其结果在开发1,25(OH)2D保健品和减肥药品方面有一定的应用前景。