1、引　言

    乙型肝炎病毒( Hepatitis B virus ,HBV) 感染是世界性的公共卫生问题,目前世界范围内有近4亿的慢性HBV 携带者,而慢性乙型肝炎是肝硬化和肝细胞癌的高危因素。HBV 属嗜肝DNA 病毒,已经证实共价闭合环状DNA (Covalently closedcircular DNA , cccDNA) 是HBV 前基因组RNA 转录的原始模板,是HBV 持续感染和抗病毒药物停用后病情反复的关键因素。根据数学模型推算得出,应用阿德福韦(Adefovir ,ADV) 可能需要1415 年才能完全清除慢性乙肝患者肝细胞中的cccDNA。

    因此,了解细胞内HBV cccDNA 的存在情况,对深入研究cccDNA 在HBV 致病机制及药物疗效评价等方面具有重要意义。现就近年来有关cccDNA 的常用检测方法及其临床意义等方面的进展作一综述。

    2、HBV cccDNA 的生物学特性

    HBV 通过肝细胞胞膜上可能存在的受体入侵肝细胞,在胞质内脱壳, 松弛环状DNA ( relaxedcircular DNA , rcDNA) 进入肝细胞核,在宿主和病毒DNA 聚合酶作用下,以负链DNA 为模板,延长修补正链DNA 裂隙区,完成正链两端连接而形成双链完整的cccDNA。cccDNA 在复制过程中,可以转录为3.5 、2.4 、2.1 、0.7 kb 等不同大小的mR－NA ,并翻译成为各种病毒蛋白。其中3.5 kb 的mRNA 作为逆转录模板,利用病毒的逆转录酶合成全长的基因组负链DNA ,再以负链DNA 作为模板,通过病毒DNA 聚合酶的作用,合成正链DNA ,与负链DNA 一起组成新的rcDNA。新合成的HBV rcDNA 大部分与病毒蛋白装配成新的完整HBV ,以芽生方式,从细胞膜上释放至细胞外,再感染健康的肝细胞。另有部分可进入细胞核内,转化为新的cccDNA ,补充细胞内的cccDNA 池。机体通过免疫清除HBV cccDNA 的途径主要有:1) 通过细胞溶解机制,清除感染的肝细胞, HBV 被巨噬细胞吞噬或与抗－HBs 抗体结合成为免疫复合物后被巨噬细胞吞噬并从尿中排出。破坏的肝细胞由新生肝细胞替代;2) 通过Th1 反应介导的依赖细胞因子的非细胞溶解机制,如干扰素、肿瘤坏死因子和白介素－2 等细胞因子清除HBV。

    3、HBV cccDNA 的主要检测方法

    以往文献报道较多的cccDNA 定量检测的方法是Sout hern blot ,该方法是分子生物学的经典方法,检测较为准确,但操作繁琐、敏感性较低且不能准确定量,需标本量也较大,故在临床上应用较少。目前对HBV cccDNA 检测的设计多是基于其与rcDNA在结构上的不同: cccDNA 两条链均是完整的,而rcDNA 在正链和负链上均有缺刻或缺口; 由于cccDNA 双链结构完整,一般不会被绿豆核酸酶等核酸外切酶降解,而rcDNA 可以被这些外切酶降解。

    3. 1 巢式聚合酶链反应( Nested polymearse chainreaction , nPCR)
　　巢式聚合酶链反应也称套式PCR。由于使用了两对引物并且进行了两轮扩增反应,实验的敏感性和特异性均增强。其引物设计的原理也是基于cccDNA 与rcDNA 结构的不同, 引物跨过环状HBV－DNA 的DR1 、DR－重复序列旁的两个缺刻。因此,cccDNA 能够被扩增,而rcDNA 则不能扩增。董庆鸣等用该法检测HBV cccDNA 标准对照质粒, 结果表明该法可以检测到5 ×10*5 拷贝/ L HBVcccDNA。

    3. 2 实时荧光定量PCR 扩增法

    He 等根据cccDNA 与rcDNA 在结构和生化特性上的不同,建立了实时荧光定量PCR 扩增法。他们将具有发光基团和淬灭基团的TaqMan 探针设计于负链缺口的下游,与负链互补。在上游引物的引导下,若负链是完整的, Taq 酶则到达Taq-Man探针所结合的位点,利用其5′→3′的外切酶活性将探针切断,从而3′端的淬灭基团失去对5′端发光集团的抑制作用,产生荧光信号。相反,若负链含有缺口,由于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺口,故不能产生荧光信号。这样,cccDNA 和rcDNA 得以区分开来。其定量检测的线性范围是1 ×10*2 ～1×10*7 拷贝/ L 。该方法对比分析了HBV 基因库中150 条已知A2G基因亚型的序列,根据保守区域设计引物,能检测A、B、C、F、G基因型,故该方法可用于90 %亚太地区的乙肝病人cccDNA 的检测。目前认为该法是临床肝穿刺标本中cccDNA 定量的金标准。}

    3. 3 嵌合引物两步法荧光定量

    Shao 等根据非cccDNA 形式的HBV 基因组存在缺口,设计由两段序列构成的嵌合引物。其3′端的12 个碱基与正链(1604～1615) 互补,结合位点为负链缺口上游DR2 缺口下游,5′端的一段与人类免疫缺陷病毒的部分基因序列一致而与HBV 基因组无同源性。首先用该嵌和引物对模板DNA 进行15 个循环的单链延伸,在该反应过程中,cccDNA 因为正链完整,引物能够顺利延伸形成一条新生链;而HBV DNA 的其他形式,如rcDNA ,由于DR2 区存在缺口,引物的延伸停止于DR2 区,不能产生单链延伸产物。新生链形成以后,设计另一对引物,一个与嵌合性引物的片段B 杂交,另一个与正链DR2 后的序列互补, 这样可以保证只能检测单链延伸反应的产物而不能直接检测HBV 基因。由于部分延伸产物存在互补区域, 通过互相杂交可形成假阳性。因此,通过采用一种依赖于A TP 的脱氧核糖核酸内切酶处理,可以消除此假阳性现象。同时,rcDNA 由于包含一个对上述脱氧核糖核酸酶敏感的单链区域, 于是Singh 等用plamid-saf teTMA TP 依赖的DNA 酶消化底物后再进行PCR 扩增,提高了实验的特异性。

    3. 4  非PCR 扩增法———入侵检测( Invader asssay)入侵检测是近年来刚开始应用的技术。其基本原理是根据目标DNA 设计一对探针,一个探针称为初始探针( Primary probe) ,另一个称为入侵探针( Invader probe) 。初始探针的5′端一段寡核苷酸序列不与目标DNA 互补,入侵探针3′末端的单个碱基不与目标DNA 互补, Flap 核酸内切酶Ⅰ( Flapendonuclease Ⅰ) 将初始探针5′端不与目标DNA互补的寡核苷酸序列剪切下来,之后此段寡核苷酸序列与具有发光基团和淬灭集团的荧光共振能量转移( Fluorescence resonance energy t ransfer ,FRET)探针相结合,从而产生荧光信号, 能够被实时荧光PCR 仪器检测。Wong 等根据此原理,分别设计了与HBV DR2 区正链下游、负链上游相结合的两种入侵探针;当正链、负链均为完整时,产生两种荧光信号,从而可检测cccDNA ;rcDNA 由于正链含有缺口,只能产生一种荧光信号,得以和cccDNA 相区分。

    4、乙肝病毒cccDNA 检测的临床意义

    4. 1 在HBV相关肝癌患者组织中的分布和在其发生发展中可能的作用
　　张涛等对20 例HBV 感染的肝癌患者肝组织采用PCR 检查cccDNA ,结果9 例癌组织、13 例癌旁组织检测出cccDNA , 并且在部分血清HBVDNA 阴性的患者中,仍可在肝组织中检测出cccD-NA 。提示cccDNA 在HBV 慢性感染的自然过程中,可能持久存在,也表明cccDNA 在癌组织和癌旁组织的分布不同。
    Wong 等对21 例表面抗原阳性的肝癌患者进行了肝内总HBV DNA 和cccDNA 的定量分析。结果显示,在表面抗原阳性的肝癌患者中,肝内总HBV DNA 水平在癌组织和非癌肝组织中没有显著差异,但癌组织中的cccDNA 高于非癌肝组织。在癌组织中,其cccDNA 占HBV DNA 比例也明显高于非癌肝组织。癌组织中cccDNA 占HBV DNA的比例较高的可能原因为: (1) 癌组织HBV 复制水平低于非癌肝组织; (2) cccDNA 池是肝癌形成过程中的副产品; (3) cccDNA 对肝癌的发生具有直接作用。

    4. 2  评价乙肝患者肝脏损伤程度的可能指标之一从理论上推测,存在于肝细胞核内的cccDNA分子在肝细胞变性、坏死时可以释放到血液中,对于同一个患者而言,肝脏损伤程度越重,变性坏死的肝细胞越多, 其血液中的cccDNA 水平也就越高。Chen 等发现乙肝患者肝组织中HBVDNA 和cccDNA 均阳性,而血清cccDNA 仅于肝炎活动时检测到,而且cccDNA 和病毒载量在谷丙转氨酶上升以前就已经上升到较高水平,一旦谷丙转氨酶水平上升, cccDNA 水平就会迅速下降; 提示血清HBV cccDNA 的检测有可能作为慢性乙肝病人HBV 活化和肝脏损伤的早期信号。

    4. 3  可能作为抗病毒药物疗效评价及停药的指标之一
　　目前临床上评价抗乙肝病毒药物疗效的主要指标包括肝功能的改善、血清HBV DNA 水平的变化、HBeAg 血清学转换以及肝组织的病理学改变等,这些指标对临床医生判断患者病情和选择抗乙肝病毒药物非常重要和实用,然而对于何时停用抗病毒药物、停用抗病毒药物后HBV 是否会重新复制活跃导致乙肝复发,仍缺乏客观有效的指标。虽然血清HBsAg 的消失或血清学的转换被认为是临床“治愈”的标准,但有研究发现,血清HBsAg 消失的患者,肝内仍可能存在HBV DNA 和cccDNA ,从而成为停药后复发的来源。目前认为,只有出现能够彻底清除cccDNA 的药物, 才能真正清除HBV ,而肝组织中cccDNA 的检测就能给治疗的时间提供参考。Werle-Lapostolle 等用实时荧光定量的方法检测了98 例处于自然史状态乙肝患者及32 例进行ADV 治疗的乙肝患者肝穿刺组织的HBV DNA 和cccDNA ;结果发现,应用ADV 治疗48 周后,患者肝细胞的cccDNA 和HBV DNA 平均下降了84 %和98 % ,并且患者外周血中HBV DNA下降的平均速率> 肝细胞的HBV DNA > 肝细胞的cccDNA。ADV 治疗时, 肝内cccDNA、肝内总HBV DNA 和血清HBV DNA 的变化与血清HB2sAg 滴度降低相关, cccDNA 拷贝数和肝内HBVDNA 水平与HBcAg ( + ) 的细胞数相关;ADV 治疗后cccDNA 水平明显下降,而HBV 抗原阳性细胞的比例没有下降,即感染的肝细胞数目并未下降,提示每个细胞内的cccDNA 水平下降了。

    Bourne 等发现肝内HBV DNA 形式能反映慢性乙型肝炎患者的血清学和病毒学应答情况,只有当肝内HBV DNA 和cccDNA 水平都下降后,才能检测到血清中HBV DNA 水平的下降; 发生HBeAg 应答的患者,其肝内HBV DNA 和cccDNA水平的绝对值下降,而与此同时cccDNA 占总HBVDNA 比例上升。

    Yuen 等对82 例接受拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者进行研究,结果显示,安慰剂组24 周和52 周的总HBV DNA 和cccDNA 水平与基线水平无统计学差异,提示HBV 感染是处于一种平衡状态的。对于在拉米夫定治疗52 周出现HBVDNA 多聚酶结构域C 的酪氨酸2甲硫氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸( Typrosine-methionine-aspartate-aspartate ,YMDD) 变异的15 例患者,其血清cccD-NA 的对数下降值低于无YMDD 变异的患者。发生YMDD 变异的患者在52 周时,其cccDNA 水平与基线水平相比无统计学差异。而对于在52 周发生YMDD 变异的患者,其在24 周时的cccDNA 较基线下降的对数值就低于无YMDD 变异的患者,提示24 周时的病毒抑制程度越大,其52 周发生YM-DD 变异的概率就越低。其机制可能是通过抑制病毒在感染的肝脏细胞内复制,降低cccDNA 的补给,从而打破cccDNA 的平衡状态。

    4. 4  作为探讨是否存在肝外复制的重要指标HBV 不仅仅是一种嗜肝病毒,一些肝外组织中也可检测到HBV DNA ,如肾脏、胰腺以及外周血单个核细胞( Perip heral blood mononuclear cell , PB-MC) 等。但关于PBMC 能否被HBV 感染的问题目前仍有争议。Torii 等报道慢性乙肝和急性乙肝恢复期患者PBMC 中均存在cccDNA ,是HBV 的肝外复制场所。郭皓宇等对17 例经拉米夫定治疗取得初步疗效而停药的患者进行研究,在复发的10 例患者中,停药时PBMC 中有9 例检出HBVcccDNA ,由此可见,HBV cccDNA 的确与停药后病毒再次复制活跃有关,甚至可能是复发的来源。Ca-brerizo 等和Stoll-Becker 等也在PBMC 中检测出cccDNA。但也有报道认为PBMC 中无cccD-NA 的存在。不同的研究者得出相反的结果,可能与HBV 感染状态、PBMC 的状态、PCR 引物的设计存在差异等因素有关。

    5、小结与展望

    目前,HBV cccDNA 的检测还没有成为临床常规的检查手段,但随着PCR 技术的进一步完善,HBV cccDNA 有可能成为临床评价抗病毒疗效的重要指标,在确定抗病毒治疗的最佳治疗方案、时间、治疗终点以建立最优的抗HBV 策略,分析机体和药物清除cccDNA 的机制,以及促进新药的研发等方面具有重要意义。同时, HBV cccDNA 的检测对研究HBV 的生物学特性、致病机制、乙型肝炎慢性化机制等方面也将具有积极的意义。
 

    （本文作者:四川大学华西医院 李红等）