肝癌是全球第5位常见的恶性肿瘤, 5年生存率<8. 5%,全球每年至少有50万人患病。对于早期肝癌患者,外科手术和局部消融可对其进行治愈性治疗,但是这些方法受肝癌的大小、肝功能储备和肝内肿瘤转移等条件的限制。因此,大部分肝癌患者不可能接受治愈性治疗。肝动脉化疗栓塞治疗可以延长不适宜进行手术切除、肝移植及消融治疗的肝癌患者的存活时间,但是要求患者有良好的肝功能储备。大多数肝癌患者具有肝硬化的疾病背景,所以对全身化疗耐受性差,治疗无效。因此,可替代的免疫治疗成为研究的热点,大量富有前景的免疫治疗途径已进入肝癌的临床实验,其中一些已经应用于临床。本文将概述近几年肝癌抗原方面的新发现和肝癌临床免疫治疗实验的结果。

    鉴定肿瘤抗原是开发肿瘤多肽疫苗的关键环节,肿瘤抗原主要包括下面几种类型:①肿瘤特异性抗原,仅在肿瘤组织中表达。②癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA),在肿瘤组织中高表达,正常组织仅在胎盘的滋养层细胞和睾丸的生殖细胞中表达。到目前为止,已经鉴定了100种以上CTA基因,分别属于44个以上不同的家族。③分化抗原,在肿瘤组织高表达,在正常起源组织也可表达。甲胎蛋白(alpha feto-protein,AFP)是一种经典的肝癌分化抗原,在50% ~80%的肝癌患者中表达,而在正常人肝组织均不表达。一些临床研究已将AFP作为肝癌免疫治疗的靶标,关于AFP人主要组织相容性复合物Ⅰ类和人主要组织相容性复合物Ⅱ类不同亚型的限制性表位已经被鉴定。近年有报道垂体肿瘤转化基因1、No-tum和BMI-1等蛋白在肝癌细胞中高表达。

    关于肝癌的大多数抗原的认识主要来自于其他肿瘤,如黑色素瘤。最初在黑色素瘤中鉴定的抗原后来发现也可以在肝癌中表达。除睾丸和胎盘外,CTA只能在肿瘤中表达。而睾丸为免疫豁免器官,因此利用CTA多肽疫苗进行肝癌免疫治疗不存在自身免疫的危险。目前为止,肝癌中最具代表性的CTA为人黑色素瘤相关抗原。研究显示,人黑色素瘤相关抗原1在65%以上肝癌患者组织中表达,是肝癌免疫治疗的理想靶标。NY-ESO-1是通过重组表达克隆的血清学鉴定技术在食管鳞状上皮细胞癌中发现的另一种CTA,通过逆转录聚合酶链反应方法显示>40%的肝癌患者表达此抗原,进一度研究表明NY-ESO-1的表达与早期肝癌具有相关性。NY-ESO-1的功能目前还不清楚,由于其免疫原性强,利用此抗原的肽段与免疫佐剂接种的临床实验研究已经开始启动。在肝癌组织表达较高的其他CTA还有人黑色素瘤相关抗原-C2、SSX-1等,这些抗原也具有潜在的治疗前景。另外,最近通过抑制消减杂交技术发现的抗原Plac1(Placenta-spe-cific 1)可在多种肿瘤组织及肿瘤细胞系中表达,而在正常组织(除胎盘外)未见表达。32%的患者肝癌组织中出现高表达,这使Plac1成为肝癌的另一个具有前景的抗原。

    2.1 肝癌的免疫治疗策略　增强肝癌患者抗肝癌免疫的常见策略包括激活抗肝癌的非特异性免疫和特异性免疫。激活抗肝癌非特异性免疫策略包括两种途径,即输入细胞因子[如干扰素γ、白细胞介素2( interleukin-2, IL-2)、肿瘤坏死因子α、IL-12、粒-巨噬细胞集落刺激因子等]增强肝癌细胞免疫原性、利用抗体激活免疫细胞的正调控信号分子(如OX40、4-BB、CD₄₀等)或封闭负调控分子(如CTLA-4、PD-1等),从而促进抗肝癌的免疫效应。而激活抗肝癌的特异性免疫策略包括主动特异性免疫和被动特异性免疫两种类型,被动特异性免疫是通过直接输入免疫效应细胞或表达抗原的抗原递呈细胞达到直接或间接杀伤肝癌细胞的目的,作用时间较短暂;而主动特异性免疫是使用肿瘤细胞疫苗或以AFP为基础的多肽疫苗来激活抗肝癌的特异性免疫,可以产生杀伤肿瘤细胞的长期效应。免疫治疗策略的主要任务是激活有效的抗肿瘤免疫反应,使免疫系统能够发现肿瘤细胞并产生免疫应答。

     2.2 肝癌免疫治疗的途径　到目前为止,应用于肝癌临床研究的免疫治疗方法主要包括下面几类:①注射细胞因子激活非特异性的免疫细胞亚型或增加肝癌细胞的免疫原性;②输注细胞因子激活的外周血淋巴细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、抗原递呈细胞等;③输入肿瘤细胞疫苗或多肽疫苗。

    2.2.1 细胞因子治疗　将具有抗肿瘤活性的细胞因子通过一定的途径注入肿瘤患者机体,产生直接或间接的肿瘤杀伤效应,从而取得一定的抗肿瘤效果。Hu等使用干扰素α和化疗试剂(包括5-氟尿嘧啶、多柔比星、顺铂等)联合治疗了76例原发性肝癌合并门静脉癌栓患者,其中29例进行了肝癌切除加癌栓取出术患者使用联合治疗,其他47例术后患者作为对照。术后治疗组0. 5、1、2、3年累积存活率及中位生存时间较对照组明显升高,提示对原发性肝癌合并门静脉癌栓的患者术后使用化疗试剂和干扰素α的联合治疗有助于提高患者的生存率。用相似的联合治疗方法对另外9例肝癌患者进行临床实验研究,通过肝动脉向患者体内输入干扰素α2b进行免疫治疗,同时使用5-氟尿嘧啶进行全身化疗。根据实体瘤的疗效评价标准对其中8例肝癌患者治疗结果的评估, 3例患者出现了部分临床反应(病灶长径总和缩小≥30%,维持4周), 1例患者病情稳定(病灶长径总和缩小<30%或增加<20% ),表明干扰素α2b和5-氟尿嘧啶联合对肝癌患者的姑息治疗具有一定的疗效。以上结果均表明干扰素α能够提高肝癌患者免疫功能,抑制和杀伤肝癌细胞,并能提高化疗的耐受性,对肝癌治疗具有促进作用。

    其他细胞因子如IL-2、IL-12、肿瘤坏死因子α、TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)等全身用药能产生抗肿瘤效果,但明显的不良反应限制了其临床应用。目前, IL-12的局部用药已用于临床实验。Sangro等用编码IL-12的腺病毒对21例消化系统晚期肿瘤患者(包括8例原发性肝癌)进行瘤内注射,治疗过程中耐受性良好。治疗后,根据世界卫生组织标准, 6例肝癌患者病情稳定(病灶最大垂直径乘积缩小<50%或增加<25%,维持4周), 1例肝癌患者有部分临床反应(病灶最大垂直径乘积缩小≥50%,维持4周)。提示IL-12能够产生抗肝癌的疗效。该课题组又使用编码IL-12的腺病毒转染的自体树突状细胞(dendritic cel,lDC)对同组17例患者(8例为肝癌患者)进行瘤内注射治疗,结果显示2例肝癌患者出现病情稳定。根据国立肿瘤研究所毒性标准( the National CancerInstitute CommonToxicityCriteria version 2. 0 )出现Ⅰ~Ⅱ级的发热、淋巴细胞减少等轻度不良反应,表明使用IL-12转染的DC接种治疗安全可靠,治疗效果不明显可能与肿瘤组织中免疫抑制因子抑制了DC的正常功能,从而降低了IL-12的表达有关。上述结果表明, IL-12在肝癌中的有效治疗途径有待进一步研究。

    2.2.2 过继性免疫治疗　过继性免疫治疗是通过向患者体内输入具有抗肿瘤活性的免疫效应细胞,直接杀伤肿瘤细胞,从而达到治疗肿瘤的目的。目前,细胞毒性T淋巴细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、细胞因子激活的杀伤细胞(cytokine-induced killer cel,lCIK)、淋巴因子激活的杀伤细胞等过继性治疗已在临床中得到应用。Takayama等报道了关于150例肝癌患者的临床实验,对肝癌手术切除后的76例患者使用体外细胞因子(IL-2和抗CD₃抗体)激活的外周血淋巴细胞进行治疗,术后74例患者未作处理作为对照。治疗无明显不良反应,治疗组复发率较对照组下降18%,其中治疗组3年无复发率(48% )高于对照组(33% ), 5年无复发率(38% )也高于对照组(22% ),表明这一治疗方法能够降低术后肝癌患者的复发率,延长术后无复发的生存时间。另一相似临床实验对经过肝动脉化疗栓塞联合射频消融术后的85例肝癌患者进行了研究,显示CIK治疗组1年复发率和1. 5年复发率比对照组明显降低,治疗组1. 5年无复发生存率(68. 9% )较对照组(20.0% )显著增高,表明CIK治疗可以减少肝癌微创术后患者的复发和提高无复发肝癌患者的存活率。由于随访时间(18个月)有限, CIK的疗效有待进一步证实。Hui等对肝癌切除术后127例肝癌患者进行了不同CIK治疗疗程的研究,治疗结果显示, CIK-Ⅰ组(接受3次CIK输入治疗)、CIK-Ⅱ组(接受6次CIK输入治疗)的1、3和5年无瘤自由生存率较对照组增加,而CIK-Ⅰ和CIK-Ⅱ治疗组之间无瘤自由生存率无差异。表明肝癌切除术后进行3次CIK输入治疗后可达到预防术后复发的效果,无需继续进行CIK治疗。同时,实验结果提示CIK-Ⅰ、CIK-Ⅱ治疗组和对照组1、3和5年总生存率无明显差异。以上实验数据均显示,过继性免疫治疗能够减少肝癌患者治愈性治疗后的复发,并提高无复发肝癌患者的存活率,关于这一治疗途径能否提高总的生存率,还需要进一步的临床实验研究。

    2.2.3 抗原递呈细胞治疗　专职抗原递呈细胞中抗原递呈能力最强的为DC,利用DC免疫激活能力的策略一直为抗肿瘤治疗研究的热点,以DC为基础的疫苗已经应用于多种实体瘤的临床实验,如黑色素瘤、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌等。目前在肝癌免疫治疗中有多种利用DC递呈抗原的途径:①使用肝癌细胞的裂解液或重组表达纯化的肝癌特异性蛋白脉冲未成熟的DC;②利用被酸洗脱的源于肝癌细胞的多肽或重组表达的肽段包被DC;③以质粒或病毒载体构建的肝癌抗原重组子转染DC,使其表达肝癌的抗原;④肝癌细胞和DC通过聚乙二醇融合或电融合,转移所有的肝癌抗原至DC,使DC杂交瘤细胞表达肝癌细胞所有的抗原分子。

    临床实验显示,使用自体肝癌细胞裂解液脉冲的DC对31例Ⅳ期肝癌患者进行治疗, 14例患者接受5次(次/周)DC静脉注射的接种治疗,另外17例患者在接受相同接种治疗后,又进行了2~12次(次/月)DC疫苗接种的加强治疗。54例未进行疫苗接种治疗Ⅳ期肝癌患者作为对照。DC疫苗治疗结果显示,治疗过程未见明显的不良反应,根据实体瘤的疗效评价标准, 14例患者出现部分临床反应, 17例患者病情稳定。整个治疗组1年生存率和2年生存率较对照组明显增高,加强治疗组中位生存时间较常规治疗组和对照组明显延长,而常规治疗组和对照组中位生存时间无明显差异。表明脉冲DC疫苗加强治疗可明显延长晚期肝癌患者的存活时间,对肝癌具有临床疗效。Palmer等最近对35例无乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染的晚期肝癌患者进行Ⅱ期临床实验,使用肝癌细胞系HepG2脉冲肝癌患者DC进行6次(次/3周)自体DC接种治疗。治疗过程未见明显的不良反应。对25例接受至少3次疫苗接种的患者进行临床反应评估,放射影像学结果显示疾病控制率(部分临床反应和病情稳定≥3个月)为28%。17例AFP≥1000μg/L的患者中有4例AFP水平下降70%以上。这些结果也证实了使用脉冲自体DC治疗能引起抗肝癌的免疫反应,对晚期肝癌具有一定的疗效。Chi等进行了DC治疗与放疗联合应用的Ⅰ期临床实验研究, 14例晚期肝癌患者进行2次(次/3周)自体未成熟DC疫苗接种治疗,每次接种前2 d接受8 Gy放射治疗。对接受2次疫苗接种治疗后的12例患者中的10例进行了免疫反应评估。结果显示治疗毒性较低,根据世界卫生组织标准, 2例患者出现部分临床反应, 4例患者出现轻微临床反应(病灶最大垂直径乘积缩小<50%,维持4周), 3例患者病情稳定(病灶最大垂直径乘积增加<25%,维持4周)。提示瘤内注射DC和放疗的联合应用对晚期肝癌的治疗安全有效,可能是由于放疗后的凋亡肿瘤细胞释放的肝癌抗原能够被未成熟的DC摄取,然后加工处理递呈给淋巴细胞,激活抗肝癌的细胞免疫。

    2.2.4 肿瘤细胞疫苗　这一方法主要是使用处理过的自体肿瘤细胞、培养的自体肿瘤细胞或异体肿瘤细胞对肿瘤患者进行免疫接种,激发或增强患者特异性抗肿瘤免疫反应。Kuang等用甲醛固定的自体肝癌细胞碎片与粒-巨噬细胞集落刺激因子、IL-2孵育,然后与结核菌素一起作为疫苗对41例手术治疗后的Ⅰ~Ⅲa期肝癌患者进行随机治疗。其中19例患者接受3次(次/2周)疫苗接种治疗, 22例患者术后未进行接种治疗作为对照。自体甲醛固定的肿瘤疫苗治疗和肝癌大小与肝癌的复发相关。其中,治疗组肝癌复发率比对照组显著降低,治疗组中位生存时间比对照组延长,治疗组无瘤生存时间和无瘤生存率明显提高。病灶<5 cm肝癌患者比病灶>5 cm患者复发率明显降低。同时治疗组总的生存率比对照组显著提高。这些结果表明肝癌术后自体甲醛固定的肿瘤疫苗治疗能够减少肝癌的复发,特别是<5 cm小肝癌的复发,而且能够提高患者总的生存率。在另一临床实验中也显示了自体肿瘤细胞疫苗的临床疗效,将术后的60例肝癌患者随机分成两组,其中30例为观察对照组,另外30例使用粒-巨噬细胞集落刺激因子、IL-2孵育的自体肿瘤细胞碎片及结核菌素进行疫苗接种。同时对24例接受肿瘤疫苗的患者接种前后的外周血淋巴细胞表型进行了分析。治疗组1、2、3年复发率比对照组明显降低,接种后外周血CD₃⁺CD₈⁺型淋巴细胞数量明显增加,CD₄⁺/CD₈⁺的比例显著降低。这些结果表明此方法能够提高CD₈⁺细胞的数量和比例,产生抗肝癌的特异性细胞免疫,从而提高患者的生存率,减少肝癌患者术后的复发率,有效地预防了肝癌术后的复发。

    2.2.5 以AFP为基础的多肽疫苗　为了使肝癌患者产生抗原特异性的免疫反应,AFP一直为很多课题组研究的目标。其中Mizukoshi等鉴定了关于AFP的5个HLA*A2402亚型的限制性表位。But-terfield等使用4种HLA*A0201亚型限制性表位的AFP肽段和免疫佐剂(Montanide ISA-51)对6例临床Ⅳ期的肝癌患者进行3次(次/2周)皮下接种治疗。结果患者AFP免疫接种安全, 6例肝癌患者中有5例出现AFP特异的T淋巴细胞免疫反应,但未见临床反应,表明含AFP免疫表位的多肽在体内具有免疫原性,并刺激肝癌患者产生AFP特异性免疫反应,但没有临床疗效。为了进一步证实AFP多肽的疗效,Butterfield等又使用这4种HLA-A0201限制性的AFP肽段脉冲的自体DC对10例Ⅲ~Ⅳ肝癌患者进行皮下接种治疗。6例外周血中与AFP肽段结合的特异性T淋巴细胞数量增加,而且外周血中产生干扰素γ的AFP特异性CD₈⁺T淋巴细胞的数量也增高,证明了以AFP为基础的疫苗的免疫活性。但是同上面的临床实验结果一样,未见任何临床反应,表明依靠单一的AFP疫苗来对晚期肝癌进行治疗,可引起针对AFP特异性的免疫反应,但不能对肝癌患者起到临床效果。这一结果可能与肝癌细胞AFP表达的异质性有关,部分肝癌细胞不表达AFP或表达水平极低,能够对AFP特异性CD₈⁺T淋巴细胞的杀伤作用产生免疫逃逸,从而影响AFP多肽疫苗的疗效。以AFP为代表肝癌相关抗原的多肽疫苗易于加工和贮存,但是单种多肽疫苗治疗作用非常有限,同时这一方法需要鉴定抗原分子中的T淋巴细胞表位,而且接受治疗的患者需要检测外周血单个核细胞人白细胞抗原表型,这些特点限制了多肽疫苗的广泛应用。多价疫苗的应用有可能改善单一疫苗治疗效果不理想的现状。

    免疫治疗是希望通过识别肿瘤的特异性蛋白而激活清除肿瘤的特异性免疫。迄今为止,一些免疫治疗途径已经显示出抗肿瘤的免疫活性,而且部分显示出抗肿瘤疗效。在肝癌的非特异性免疫策略中,细胞因子与化疗联合应用取得较好的效果,而单一细胞因子注射对肝癌疗效较弱。细胞因子全身用药的毒性反应限制了其临床应用,肿瘤组织局部注射成为其主要用药方式。这一治疗方法能够上调免疫效应细胞,特别是肿瘤特异性T淋巴细胞的抗肿瘤效应,但是不能特异性地防止肿瘤效应细胞的死亡。使用多种细胞因子联合治疗,即上调免疫效应细胞又保护肿瘤效应细胞远离肿瘤诱导的凋亡,将会产生更持久的抗肿瘤效果。抗体介导的激活免疫细胞的正调控信号分子4-BB、CD₄₀或封闭负调控分子PD-1在体外肝癌细胞或肝癌动物模型中显示出一定的疗效,而抗CT-LA-4单克隆抗体已在前列腺癌的临床实验显示出抗肿瘤的效果。这些实验结果让人们对这一途径能否应用于肝癌的临床实验研究充满了期待。肝癌的被动特异性免疫治疗的策略主要是通过输注免疫效应细胞(如肿瘤浸润淋巴细胞)直接杀伤肝癌细胞,或应用抗原递呈细胞(如成熟或未成熟DC)表达肝癌相关的抗原以刺激机体免疫杀伤肿瘤细胞,解决了肝癌组织中肿瘤浸润性淋巴细胞功能低下和成熟抗原递呈细胞发育异常的问题,并起到了较好的临床疗效。但是被动特异性免疫维持的时间短,治疗过程患者需要不断的输入免疫效应细胞和抗原递呈细胞。而这些细胞培养和鉴定的过程复杂,费用昂贵,同时这些细胞的最佳来源和最佳免疫途径等问题给临床的应用带来了一定的限制。同上一治疗策略相比,肝癌的主动特异性免疫治疗策略克服了肿瘤杀伤效应维持时间短暂的问题。目前在这一策略的临床治疗途径中,肿瘤细胞疫苗的治疗能减少早期肝癌患者术后的复发和促进肝癌患者的存活,但是以AFP为基础的疫苗治疗在肝癌患者未显示出临床疗效。这一策略是使用抗原(瘤苗形式)刺激机体产生持久的特异性免疫应答,主要是为了解决肝癌组织中的抗原不能被免疫细胞有效的识别和递呈的问题。但是肿瘤细胞疫苗治疗与以AFP为基础的疫苗治疗出现了不同的临床效果,这一事实可能与疫苗中抗原的种类有关。这两种治疗途径出现不同临床效果的事实可能与疫苗中抗原的种类有关。肝癌细胞疫苗中包含了多种抗原,接种后肝癌患者能够产生针对多种抗原的细胞毒性T淋巴细胞,从而产生强大的抗肿瘤免疫反应。AFP多肽疫苗只能引起针对AFP特异性的免疫反应,而肝癌细胞AFP抗原表达存在一定的异质性,从而抑制了临床疗效。同时肝癌细胞也可能含有正常组织蛋白的抗原,所以肝癌细胞疫苗的应用增加了自身免疫的风险。总之,单一的免疫治疗途径效果有限,多种途径的联合应用已成为肝癌临床实验的主要方式。肝癌单一疫苗及联合疫苗的标准化治疗已开始起步,随着未来大规模的随机对照临床实验研究的开展,肝癌免疫治疗效果会得到进一步证实,免疫治疗将在肝癌中拥有广阔的应用前景。

    （本文作者：广西医科大学研究生学院 吴春林）