【关键词】  肝豆状核变性； X线能谱分析； 诊断

Clinical diagnosis of two fulminate Wilson disease cases   YI Lu-xi, YANG Xu, CHEN Han-chun, ZHOU Jian-hua, WU Xiao-ying.

【Key words】     Wilson disease;    X-ray energy-dispersion;    Diagnosis

【First author’s address】   Department of Infectious Diseases, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410013, China

Email: hongmeizi1@  hotmail.com

 

暴发性肝豆状核变性（fulminant Wilson disease，FWD）是肝豆状核变性病（WD）的一种少见而严重的临床类型[1]，临床表现与其他原因引起的暴发型肝衰竭类似，国内外鲜见从临床、病理和分子生物学多个水平追踪观察的报道。我们对2例典型FWD的临床、病理和基因突变特点进行了分析，以提高对WD的认知性和诊断水平。

一、资料与方法

1. 对象及标本：先症者为我科住院患者，符合“第八届肝豆状核变性国际研讨会”公布的WD诊断标准[2]；家系成员包括患者父母及弟弟；病理标本为先症者尸解或活检组织；DNA标本从外周血提取。

2. 主要试剂：Tris碱购自Bio-Rad公司；硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸纳（SDS）、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、乙酸钾、冰醋酸、无水乙醇、溴乙锭（EB）等均为国产分析纯品；细胞裂解缓冲液、PBS缓冲液、TE缓冲液自行配制；Pfu酶购自美国Promega公司，dNTP购自日本TaKaRa公司；100bp DNA相对分子质量标准购自立陶宛Fermentas公司；琼脂糖购自法国Bio West公司；蛋白酶K购自德国Merck公司，RNase A购自美国GenView公司；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

3. 方法：（1）血清铜蓝蛋白测定采用速率散射比浊法；尿铜测定采用火焰原子吸收光谱法。（2）病理检查：光镜检查按常规进行。电镜检查包括取材、固定、后固定、梯度脱水、浸泡、包埋、修块、定位；采用瑞典产LKB-Ⅲ型超薄切片机切片，用醋酸铀、硝酸铅双重染色；用日产H-800型透射电镜观察、照相。（3）电子探针元素分析：超薄切片（厚约500埃）后，用金网捞片，用FEITecnai G220 TEM电镜（带EDAX能谱仪）测试；在特征性颗粒上，利用X-射线能谱仪会聚光斑进行元素分析。（4）DNA提取和PCR扩增DNA按常规进行，应用软件进行在线分析。

二、结果

1. 临床资料：病例1，女，14岁，因腹胀、乏力、食欲不振、皮肤巩膜黄染2个月，黑便余10d，神志不清1d入院。曾诊断为“重症肝炎”。体格检查：血压 86/48mmHg，深度昏迷，皮肤巩膜深度黄染，大片淤斑；双下肺可闻及湿罗音，心率105次/min；腹隆起，肝肋下未扪及，脾肋下1cm，质中，边缘钝，表面光滑，腹水征阳性；双下肢浮肿，克、布氏征阳性。大便隐血试验（+++）， 血常规Hb 76g/L, 肝功能检查显示ALT 51.9U/L, TBil 556.76μmol/L, DBil 249.43μmol/L；BUN 11.48mmol/L；肝炎病原学检查均为阴性；CT扫描检测显示：左下肺感染；双侧少量胸腔积液；结节性肝硬化，腹水，脾大；胰腺体稍微增大。入院诊断：肝硬化（失代偿期），肝性脑病，肺部感染，上消化道出血，继发性贫血。入院后予抗肝性脑病、止血、抗感染、利尿、输血等对症支持治疗。病情进一步恶化，昏迷加深，肝肾衰竭严重，经抢救无效，4d后死亡。住院期间查血清铜蓝蛋白68.10mg/L，尿铜12.61mg/d；死亡诊断：肝豆状核变性；死亡原因：多器官功能衰竭。病例2，女，12岁，因头晕、乏力5d入院，诊断为“肾炎综合征”、“中度贫血”，予抗感染等治疗后好转出院。1个月后症状加重，伴呕吐、低热、眼尿黄再次入院。体查：皮肤巩膜深度黄染，肝右肋下1.5cm，脾左肋下2cm。血WBC 47×109/L, Hb 83g/L；尿蛋白（+++），红细胞（+++）；肝功能检测显示：ALT 97.20U/L, TBil 276.50μmol/L, DBil 114.10μmol/L；BUN 8.34mmol/L。入院诊断：溶血性贫血，肾炎综合征。入院后予抗感染、输血等对症支持治疗，出现尿少、黄疸进行性加深，查铜蓝蛋白降低，尿铜明显增高，角膜有K-F环，肾穿刺活检示“系膜增生性肾小球肾炎”，确诊为“肝豆状核变性”。予护肝、利尿、青霉胺等治疗无缓解，进一步出现肢体震颤、右上腹痛、腹水、黑便、肝性脑病等，抢救无效死亡。

2. 病理检查结果：病例1：肝大小23.5cm×13.0cm×6.0cm，布满大小结节。光镜下可见弥漫性或灶性肝细胞脂肪变性、萎缩，胞浆含有大量棕褐色脂褐素颗粒；大片区域或灶状区域肝细胞坏死，部分肝细胞核有糖原性空泡形成，伴间质淋巴细胞浸润，小胆管增生；假小叶形成，肝硬化，胆汁淤积。肾近曲小管上皮细胞水变性,肾小管内有棕色素性管型；肾上腺未见色素沉着。脑双侧基底核变性水肿，神经细胞核变性坏死，脑膜渗出性炎症，左枕部蛛网膜下腔积脓，左颞部、第三脑室周见局灶性软化灶，小脓肿形成。双肺小叶性肺炎并出血性肺炎，肺小脓肿形成；肺表面有出血，切面有黄色脓性分泌物。虹膜上皮灶性乳头状增生，睫状肌有棕色色素沉着。脾肿大，瘀血、出血，脾小结减少；脾窦显著扩张充血，窦内皮细胞及组织细胞增生，脾被膜增厚。胰腺未见出血。回肠、结肠节段性溃疡性慢性肠炎，部分肠壁全层急慢性炎细胞浸润。胆囊慢性炎症，结石。心肌间质水肿，少量炎症细胞浸润。胸腔积血、积水。病理诊断：肝豆状核变性并肝硬化。电镜检查结果显示：肝细胞浆内较多颗粒状高电子密度沉积物，部分颗粒中有大小不一的空泡，细胞间隙增宽，胶原纤维增生；线粒体大小、形态不一。肾近端肾小管上皮内见上皮细胞扁平，刷状缘消失，基底膜增厚。肾小管上皮细胞间隙增大，细胞间连接减少，线粒体密度增高，肾间质纤维化，铜在近端小管上皮沉着。随机选取两个肝细胞内颗粒，利用X-射线能谱仪会聚光斑进行元素分析，可见铜、铁峰值明显增高（正常者无峰）。

病例2病理检查结果显示：光镜下见部分肾小球肿胀，球内系膜基质细胞数稍增生，局灶系膜基质稍增多伴系膜区略增宽，近曲肾小管上皮细胞水变性。病理诊断：轻度局灶节段性系膜增生性肾小球肾炎。裂隙灯下观察到眼角膜有K-F环。

3. 患者基因检测及家系分析结果：病例1先症者及其父母的基因全长21个外显子均未发现突变。病例2先症者第13号外显子的33500507位有“C/T”杂合突变，为一已知突变。先症者父亲和弟弟第13号外显子的33500706位有“G/T”杂合突变。先证者为患者，父母亲非近亲结婚，家族成员表型正常。

三、讨论

WD临床表现复杂、基因突变多且有区域差别，不同的国家和学科对WD认识的角度有偏差，诊断参照依据不一。2002年第八届WD国际研讨会讨论推荐了一套诊断体系[2]，但在临床应用时，尽管都能经综合分析明确诊断，但仍有困惑。迫切需要在借鉴国外经验的基础上研究制定一套我国自行的诊断标准。

WD发生的分子基础是ATP7B基因突变，且突变多，缺乏对黄色人种WD基因外显子全面测序筛查的基础数据和对突变情况的完整认识，是制约其基因诊断的瓶颈。我们对被测对象及其家系成员的基因全长21个外显子进行了研究。病例2先证者第13号外显子发现有33500706位点的“C/T”杂合突变，为一自发错义点突变，病例1则未发现突变，需进一步研究探讨。WD的病因是铜蓝蛋白降低所致铜代谢异常，但铜蓝蛋白前体功能的改变同样也可导致铜蓝蛋白水平的降低，那么，编码铜蓝蛋白前体基因的异常也可能是WD的分子病因，或者WD基因与之联合作用也能致病。

WD基因突变具有遗传异质性，世界各地的突变热点存在差异，我国学者研究证实第8和12号外显子为我国WD基因突变热区[3]。病例2在先症者及其父亲和弟弟的第13号外显子同时发现了突变，既为我国WD基因突变的研究提供了新的依据，证实本例FWD的突变未发生在过去曾报道的突变热区，也提示第13号外显子的突变可能与FWD这一临床表型之间存在某种相关性。

WD的发病机制是铜代谢异常导致肝脏及脑等组织中铜沉积而产生毒性损伤[4]。铜蓝蛋白参与铜的代谢，其减少继发于ATP7B基因突变[5]。2例FWD均表现为铜蓝蛋白明显降低，符合WD的诊断。此外，WD可致血液循环中非铜蓝蛋白结合铜和游离铜的含量增加，进而导致从肾脏排泄的铜增加。24h尿铜的检测无创伤、操作方便，易为患者接受，是WD的诊断和治疗监测常用的指标。陈红英等[6]通过对WD和正常人24h尿铜含量的检测，证实其可作为WD诊断的参考依据。FWD时大量的铜从坏死的肝细胞中释放到血液循环，血液中铜的含量迅速升高。2例FWD的尿铜均极度增高，反映了肝细胞的大量坏死。

长期以来，对WD患者铜代谢的检测基本局限于铜蓝蛋白和24h尿铜的测定。我们在肝脏组织超微病理检测的基础上，选取肝细胞内可疑颗粒做电子探针检测，利用X-射线能谱仪会聚光斑，进行点的元素分析，发现铜、铁的峰值明显增高，提示颗粒中含铜、铁较多。该研究通过最直接的手段检测到了铜在肝组织中的沉积，为WD的诊断提供了一种精确而简便的方法。

我国尚未形成系统的WD病理诊断方法，对全身器官进行系统组织学检查者鲜见报道。病例1尸体解剖后对肝、肾、脑、脾、肺等器官进行了组织学显微和超微结构检查，发现铜对肝脏的损害相当严重，与文献报道的基本吻合，同时也提示WD应在组织发生不可逆损伤之前尽早诊断。由于线粒体的变化出现早，对疑似患者进行肝组织超微结构检查，不失为一种早期诊断的有效手段。随着血浆铜的升高，一部分铜被肾脏滤过，从血浆中清除，铜在肾脏的蓄积可引起肾脏损害[7]。2例先症者的肾脏病理检查均异常，不仅证实了铜对肾脏的损害，更是对WD病理资源的有益补充。

铜在角膜后缘弹力层内沉积，可形成特征性的色素环，病例2经眼科检查发现有典型的色素环，支持诊断。

参  考  文  献

[1]Schilsky ML. Diagnosis and treatment of Wilson’s disease. Pediatr Transplant, 2002, 6: 15-19.

[2]Ferenci P, Caca K, Loudianos G, et al. Diagnosis and phenotypic classification of Wilson disease. Liver Int, 2003, 23:139-142.

[3]Fan YX, Yu L, Jiang Y, et al. Identification of a mutation hotspot in exon 8 of Wilson disease gene by cycle sequencing. Chn Med J (Egl), 2000, 113: 172-174.

[4]Langner C, Denk H. Wilson disease. Virchows Arch, 2004, 445: 111-118.

[5]Forbes JR, Cox DW. Copper-dependent trafficking of Wilson disease mutant ATP7B proteins. Hum Mol Genet, 2000, 9: 1927-1935.

[6]Chen HY, Lin GY, Zheng WH. Determination of urine copper in the patients with Wilsons disease for 24 h. Guangdong Weiliang Yuansu Kexue, 2000, 7: 32-33.

陈红英，林广云，郑文晖.肝豆状核变性病人24小时尿铜含量的测定.广东微量元素科学,2000,7:32-33.

[7]Yang X. Hepatolenticular degeneration. Changsha: Central South University, 2006.

杨旭.肝豆状核变性.长沙:中南大学出版社,2006.